HGF及EGF體外誘導(dǎo)VEGF165基因修飾BMSCs向肝細胞分化的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、第一章骨髓間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)、生物學(xué)鑒定及VEGF165質(zhì)粒的擴增
   目的:1.建立兔骨髓基質(zhì)細胞(BMSCs)體外分離、培養(yǎng)、增殖、凍存的方法,以及探討其生物學(xué)特性。2.VEGF165-pCMV6-AC-GFP質(zhì)粒的擴增及鑒定。
   方法:采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離純化、擴增BMSCs,用流式細胞學(xué)及免疫細胞化學(xué)鑒定BMSCs,光學(xué)顯微鏡及掃描電鏡觀察BMSCs的細胞形態(tài)及生長特性,測定第1、3、5代B

2、MSCs及10%、15%、25%FBS培養(yǎng)第3代BMSCs的生長曲線。BMSCs在10%DMSO條件下經(jīng)液氮或-60℃凍存復(fù)蘇,測其成活率及增殖能力。VEGF165-pCMV6-AC-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌并擴增、抽提,檢測濃度及純度。
   結(jié)果:BMSCs為貼壁生長,呈均一的梭形成纖維細胞樣,流式細胞學(xué)顯示BMSCs明顯表達CD29(93.41%±3.2%,n=3)和CD44(91.55%±4.1%),而不表達CD45(3.

3、95%±2.9%)和CD34(3.36%±3.6%),免疫細胞化學(xué)顯示CD29和CD44表達陽性, CD45和CD34呈陰性。BMSCs生長曲線呈S型,1-3d為潛伏期,生長較慢;3d后進入對數(shù)生長期,步入快速增長;7-8 d為平臺期,細胞增殖速度趨于平緩。以15%FBS及第1代BMSCs生長狀態(tài)最佳。BMSCs復(fù)蘇后細胞活力達90%以上,其生長形態(tài)與凍存前無明顯差異,可用于后續(xù)試驗研究。提取的VEGF165-pCMV6-AC-GFP質(zhì)

4、粒的純度、濃度分別為1.83,0.75ug/ul,可應(yīng)用于細胞轉(zhuǎn)染試驗研究。
   結(jié)論:1.采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離純化、擴增BMSCs可行。2.兔BMSCs增殖能力強,易體外分離、純化、擴增,傳代的BMSCs可保持其原有的生物學(xué)特性。3.凍存后復(fù)蘇的BMSCs仍有較強的增殖能力。4.成功擴增高純度的VEGF-pCMV6-AC-GFP質(zhì)粒。
   第二章構(gòu)建VEGF165-pCMV6-AC-GFP基因修飾的

5、BMSCs
   目的:比較脂質(zhì)體2000及電穿孔兩種轉(zhuǎn)染方法,為BMSCs基因轉(zhuǎn)染提供可行方案,并建立最佳的轉(zhuǎn)染條件。
   方法:1.體外分離、擴增兔BMSCs,分別用脂質(zhì)體2000、電穿孔轉(zhuǎn)染第3代BMSCs,用顯微鏡觀察細胞形態(tài)學(xué)變化及GFP熒光表達,繪制生長曲線觀察細胞的增殖能力,用細胞流式法比較兩種方法的轉(zhuǎn)染效率。2.選擇可行方案并優(yōu)化轉(zhuǎn)染參數(shù),通過選擇不同的電穿孔緩沖液(Opti-DMEM,含血清全培養(yǎng)基及

6、D-Hanks液),選擇不同的電壓(250V,280V,310V),不同的質(zhì)粒量(20ug,50ug,70ug)的條件下進行電轉(zhuǎn),用顯微鏡觀察細胞形態(tài)學(xué)變化及GFP熒光表達,用細胞流式法比較兩種方法的轉(zhuǎn)染效率。3.以最優(yōu)轉(zhuǎn)染參數(shù)電轉(zhuǎn)BMSCs后,用200ug/ml G418篩選電轉(zhuǎn)后48h的BMSCs,用RT-PCR檢測BMSCs電轉(zhuǎn)后不同時間點VEGF165的表達情況。用單因素方差分析所得數(shù)據(jù),以a=0.05為檢驗水準。
  

7、 結(jié)果:脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染后BMSCs的GFP熒光數(shù)稀少,電穿孔轉(zhuǎn)染的GFP熒光數(shù)較多,轉(zhuǎn)染效率分別為5.12%、17.3%。脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染后BMSCs生長曲線呈水平下降型,細胞幾乎沒有增殖,后期細胞逐漸死亡,電穿孔轉(zhuǎn)染后BMSCs生長曲線仍呈S型。Opti-DMEM,含血清DMEM及D-Hanks液電穿孔轉(zhuǎn)染效率分別是15.27%,10.53%,13.91%。250V,280V,310V電壓電轉(zhuǎn)后,臺盼藍測定細胞活力分別為75.6

8、%,60.12%,42.59%。20ug,50ug,70ug質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)效率分為14.10%、27.44%、40.57%。隨著電壓的增大及質(zhì)粒量的增多,轉(zhuǎn)染效率增高,細胞死亡數(shù)也同樣增加。用200ug/mlG418篩選20天后轉(zhuǎn)染效率達70.46%。RT-PCR示:G418篩選20天后BMSCs的VEGF165基因表達明顯增加(P<0.05),去除篩選1W后VEGF基因水平稍降低,第2W和第3W后未見明顯差異(P)0.05)。
  

9、 結(jié)論:電穿孔法較脂質(zhì)體2000更適用于BMSCs基因轉(zhuǎn)染,并保存了BMSCs細胞形態(tài)及增殖能力。電穿孔轉(zhuǎn)染最佳參數(shù)方案:2×106cells/ml,50ug質(zhì)粒,電壓280V,電容量1000Uf,電阻無窮大,脈沖一次。經(jīng)200ug/ml G418篩選后可達到較高轉(zhuǎn)染效率。
   第三章VEGF基因?qū)w外誘導(dǎo)兔BMSCs向肝細胞分化影響的實驗研究
   目的:探討VEGF165-pCMV6-AC-GFP修飾的BMSCs

10、在HGF和EGF誘導(dǎo)下體外向肝細胞分化的能力,研究VEGF165基因?qū)MSCs向肝細胞分化的影響。
   方法:分離、培養(yǎng)兔BMSCs,VEGF165-pCMV6-AC-GFP質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染第3代BMSCs,用G418篩選轉(zhuǎn)染效率達70%,再分組如下:A組:HGF(60ng/ml)+EGF(45ng/ml)+電轉(zhuǎn)pCMV6-AC-GFP空載質(zhì)粒,B組:HGF(60ng/ml)+EGF(45ng/ml)+電轉(zhuǎn)VEGF165-pCMV

11、6-AC-GFP質(zhì)粒。于0、10、20天用光鏡及掃描電鏡觀察BMSCs細胞形態(tài)及表面結(jié)構(gòu),用免疫細胞化學(xué)、細胞免疫熒光、Western-blot檢測肝系細胞特異性標志:AFP和ALB,用實時-定量PCR檢測ALB基因水平。用兩因素方差分析所得數(shù)據(jù),以a=0.05為檢驗水準。
   結(jié)果:誘導(dǎo)14d后,BMSCs細胞呈短梭形和多角形。隨誘導(dǎo)時間延長,多角形細胞增多,并可形成肝細胞樣細胞集落。免疫細胞化學(xué)及免疫熒光示第10天:A組及

12、B組的AFP表達陽性,A組ALB表達陰性,而B組的ALB表達陽性,第20天:A組及B組的AFP、ALB均為陽性。Western-blot示: B組的ALB表達水平較A組更早、更多(P<0.05);然而隨著時間的延長,B組AFP表達水平下降,第20天時較A組明顯減少(P<0.05)。實時-定量PCR示第10天,兩組均檢測到了ALB基因,隨誘導(dǎo)時間的延長,各組的ALB基因含量增加(P<0.05),A組、B組的ALB基因含量在同一時間點沒有顯

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