HGF及EGF體外誘導(dǎo)VEGF165基因修飾BMSCs向肝細(xì)胞分化的研究.pdf

1、第一章骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)、生物學(xué)鑒定及VEGF165質(zhì)粒的擴(kuò)增
　　 目的:1.建立兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)體外分離、培養(yǎng)、增殖、凍存的方法，以及探討其生物學(xué)特性。2.VEGF165-pCMV6-AC-GFP質(zhì)粒的擴(kuò)增及鑒定。
　　 方法:采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離純化、擴(kuò)增BMSCs，用流式細(xì)胞學(xué)及免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定BMSCs，光學(xué)顯微鏡及掃描電鏡觀察BMSCs的細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)特性，測(cè)定第1、3、5代B

2、MSCs及10％、15％、25％FBS培養(yǎng)第3代BMSCs的生長(zhǎng)曲線。BMSCs在10％DMSO條件下經(jīng)液氮或-60℃凍存復(fù)蘇，測(cè)其成活率及增殖能力。VEGF165-pCMV6-AC-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌并擴(kuò)增、抽提，檢測(cè)濃度及純度。
　　 結(jié)果:BMSCs為貼壁生長(zhǎng)，呈均一的梭形成纖維細(xì)胞樣，流式細(xì)胞學(xué)顯示BMSCs明顯表達(dá)CD29(93.41％±3.2％，n=3)和CD44(91.55％±4.1％)，而不表達(dá)CD45(3.

3、95％±2.9％)和CD34(3.36％±3.6％)，免疫細(xì)胞化學(xué)顯示CD29和CD44表達(dá)陽(yáng)性， CD45和CD34呈陰性。BMSCs生長(zhǎng)曲線呈S型，1-3d為潛伏期，生長(zhǎng)較慢;3d后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，步入快速增長(zhǎng);7-8 d為平臺(tái)期，細(xì)胞增殖速度趨于平緩。以15％FBS及第1代BMSCs生長(zhǎng)狀態(tài)最佳。BMSCs復(fù)蘇后細(xì)胞活力達(dá)90％以上，其生長(zhǎng)形態(tài)與凍存前無(wú)明顯差異，可用于后續(xù)試驗(yàn)研究。提取的VEGF165-pCMV6-AC-GFP質(zhì)

4、粒的純度、濃度分別為1.83，0.75ug/ul，可應(yīng)用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)研究。
　　 結(jié)論:1.采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離純化、擴(kuò)增BMSCs可行。2.兔BMSCs增殖能力強(qiáng)，易體外分離、純化、擴(kuò)增，傳代的BMSCs可保持其原有的生物學(xué)特性。3.凍存后復(fù)蘇的BMSCs仍有較強(qiáng)的增殖能力。4.成功擴(kuò)增高純度的VEGF-pCMV6-AC-GFP質(zhì)粒。
　　 第二章構(gòu)建VEGF165-pCMV6-AC-GFP基因修飾的

5、BMSCs
　　 目的:比較脂質(zhì)體2000及電穿孔兩種轉(zhuǎn)染方法，為BMSCs基因轉(zhuǎn)染提供可行方案，并建立最佳的轉(zhuǎn)染條件。
　　 方法:1.體外分離、擴(kuò)增兔BMSCs，分別用脂質(zhì)體2000、電穿孔轉(zhuǎn)染第3代BMSCs，用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及GFP熒光表達(dá)，繪制生長(zhǎng)曲線觀察細(xì)胞的增殖能力，用細(xì)胞流式法比較兩種方法的轉(zhuǎn)染效率。2.選擇可行方案并優(yōu)化轉(zhuǎn)染參數(shù)，通過(guò)選擇不同的電穿孔緩沖液(Opti-DMEM，含血清全培養(yǎng)基及

6、D-Hanks液)，選擇不同的電壓(250V，280V，310V)，不同的質(zhì)粒量(20ug，50ug,70ug)的條件下進(jìn)行電轉(zhuǎn)，用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及GFP熒光表達(dá)，用細(xì)胞流式法比較兩種方法的轉(zhuǎn)染效率。3.以最優(yōu)轉(zhuǎn)染參數(shù)電轉(zhuǎn)BMSCs后，用200ug/ml G418篩選電轉(zhuǎn)后48h的BMSCs，用RT-PCR檢測(cè)BMSCs電轉(zhuǎn)后不同時(shí)間點(diǎn)VEGF165的表達(dá)情況。用單因素方差分析所得數(shù)據(jù)，以a=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　

7、 結(jié)果:脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染后BMSCs的GFP熒光數(shù)稀少，電穿孔轉(zhuǎn)染的GFP熒光數(shù)較多，轉(zhuǎn)染效率分別為5.12％、17.3％。脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染后BMSCs生長(zhǎng)曲線呈水平下降型，細(xì)胞幾乎沒(méi)有增殖，后期細(xì)胞逐漸死亡，電穿孔轉(zhuǎn)染后BMSCs生長(zhǎng)曲線仍呈S型。Opti-DMEM，含血清DMEM及D-Hanks液電穿孔轉(zhuǎn)染效率分別是15.27％，10.53％，13.91％。250V，280V，310V電壓電轉(zhuǎn)后，臺(tái)盼藍(lán)測(cè)定細(xì)胞活力分別為75.6

8、％，60.12％，42.59％。20ug，50ug，70ug質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)效率分為14.10％、27.44％、40.57％。隨著電壓的增大及質(zhì)粒量的增多，轉(zhuǎn)染效率增高，細(xì)胞死亡數(shù)也同樣增加。用200ug/mlG418篩選20天后轉(zhuǎn)染效率達(dá)70.46％。RT-PCR示:G418篩選20天后BMSCs的VEGF165基因表達(dá)明顯增加(P＜0.05)，去除篩選1W后VEGF基因水平稍降低，第2W和第3W后未見(jiàn)明顯差異(P)0.05)。
　　

9、 結(jié)論:電穿孔法較脂質(zhì)體2000更適用于BMSCs基因轉(zhuǎn)染，并保存了BMSCs細(xì)胞形態(tài)及增殖能力。電穿孔轉(zhuǎn)染最佳參數(shù)方案:2×106cells/ml，50ug質(zhì)粒，電壓280V，電容量1000Uf，電阻無(wú)窮大，脈沖一次。經(jīng)200ug/ml G418篩選后可達(dá)到較高轉(zhuǎn)染效率。
　　 第三章VEGF基因?qū)w外誘導(dǎo)兔BMSCs向肝細(xì)胞分化影響的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:探討VEGF165-pCMV6-AC-GFP修飾的BMSCs

10、在HGF和EGF誘導(dǎo)下體外向肝細(xì)胞分化的能力，研究VEGF165基因?qū)MSCs向肝細(xì)胞分化的影響。
　　 方法:分離、培養(yǎng)兔BMSCs，VEGF165-pCMV6-AC-GFP質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染第3代BMSCs，用G418篩選轉(zhuǎn)染效率達(dá)70％，再分組如下:A組:HGF(60ng/ml)+EGF(45ng/ml)+電轉(zhuǎn)pCMV6-AC-GFP空載質(zhì)粒，B組:HGF(60ng/ml)+EGF(45ng/ml)+電轉(zhuǎn)VEGF165-pCMV

11、6-AC-GFP質(zhì)粒。于0、10、20天用光鏡及掃描電鏡觀察BMSCs細(xì)胞形態(tài)及表面結(jié)構(gòu)，用免疫細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞免疫熒光、Western-blot檢測(cè)肝系細(xì)胞特異性標(biāo)志:AFP和ALB，用實(shí)時(shí)-定量PCR檢測(cè)ALB基因水平。用兩因素方差分析所得數(shù)據(jù)，以a=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　 結(jié)果:誘導(dǎo)14d后，BMSCs細(xì)胞呈短梭形和多角形。隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，多角形細(xì)胞增多，并可形成肝細(xì)胞樣細(xì)胞集落。免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫熒光示第10天:A組及

12、B組的AFP表達(dá)陽(yáng)性，A組ALB表達(dá)陰性，而B(niǎo)組的ALB表達(dá)陽(yáng)性，第20天:A組及B組的AFP、ALB均為陽(yáng)性。Western-blot示: B組的ALB表達(dá)水平較A組更早、更多(P＜0.05);然而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，B組AFP表達(dá)水平下降，第20天時(shí)較A組明顯減少(P＜0.05)。實(shí)時(shí)-定量PCR示第10天，兩組均檢測(cè)到了ALB基因，隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，各組的ALB基因含量增加(P＜0.05)，A組、B組的ALB基因含量在同一時(shí)間點(diǎn)沒(méi)有顯