攜帶Ad-VEGF165轉(zhuǎn)基因細(xì)胞絲素膜誘導(dǎo)角膜血管化和Ad-hIL-17F抑制作用.pdf

1、目的：研究攜帶Ad-VEGF165轉(zhuǎn)基因角膜上皮細(xì)胞(HCECs)再生絲素膜誘導(dǎo)角膜血管化作用及分子機(jī)制；構(gòu)建hIL-17F腺病毒載體(Ad-hIL-17F)，研究其抑制角膜血管化作用及分子機(jī)制。
　　 方法：⑴再生絲素膜與角膜組織相容性研究。體外實(shí)驗(yàn)：光學(xué)顯微鏡及掃描電鏡觀察再生絲素膜培養(yǎng)HCECs形態(tài)，MTT法檢測再生絲素膜對(duì)HCECs生長曲線的影響，ELISA檢測絲素膜對(duì)HCECs自分泌VEGF、Ang1、EGF、TGF-

2、b等細(xì)胞因子的影響。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：兔角膜基質(zhì)內(nèi)植入再生絲素膜，動(dòng)態(tài)觀察結(jié)膜充血、角膜水腫、角膜新生血管面積，免疫組織化學(xué)檢測兔角膜中CD34，I型、III型膠原等蛋白的表達(dá)。⑵攜帶Ad-VEGF165轉(zhuǎn)基因細(xì)胞再生絲素膜誘導(dǎo)角膜血管化作用及分子機(jī)制研究。體外實(shí)驗(yàn)：再生絲素膜培養(yǎng)HCECs，Ad-VEGF165予以基因轉(zhuǎn)染，RT-PCR檢測轉(zhuǎn)基因細(xì)胞VEGF mRNA的轉(zhuǎn)錄，Western blot檢測轉(zhuǎn)基因細(xì)胞VEGF的表達(dá)，ELISA法檢

3、測轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)上清VEGF、Ang1、EGF、TGF-b的表達(dá)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：兔角膜基質(zhì)內(nèi)植入Ad-VEGF165轉(zhuǎn)基因細(xì)胞修飾再生絲素膜，動(dòng)態(tài)觀察結(jié)膜充血、角膜水腫、新生血管面積，免疫組織化學(xué)檢測兔角膜中CD34、VEGF、I型膠原、III型膠原、TGF-b、MMP-2等蛋白的表達(dá)。⑶Ad-hIL-17F構(gòu)建及抑制角膜新生血管作用。將構(gòu)建正確的Ad-hIL-17F重組腺病毒載體經(jīng)RT-PCR和間接免疫熒光法鑒定。MTT法檢測Ad-hIL

4、-17F對(duì)ECV304細(xì)胞的生長抑制作用，實(shí)時(shí)定量RT-PCR、ELISA法檢測Ad-hIL-17F對(duì)ECV304細(xì)胞中VEGF轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的影響。攜帶轉(zhuǎn)基因細(xì)胞再生絲素膜植入角膜內(nèi)制備兔角膜新生血管模型，術(shù)后1周結(jié)膜下注射Ad-hIL-17F，觀察結(jié)膜充血、新生血管面積，免疫組織化學(xué)檢測兔角膜中CD34、VEGF等的表達(dá)。
　　 結(jié)果：①HCECs在再生絲素膜上生長良好，兔角膜基質(zhì)內(nèi)植入再生絲素膜角膜能維持透明，未見明顯新生血管

5、長入，未見移植片脫落，未見感染以及眼前房內(nèi)的炎癥反應(yīng)。②Ad-VEGF165轉(zhuǎn)基因HCECs培養(yǎng)上清中VEGF表達(dá)增加，同時(shí)新生血管相關(guān)細(xì)胞因子Ang1、EGF、TGF-b等表達(dá)均增加，Ad-VEGF165轉(zhuǎn)基因HCECs再生絲素膜植入后角膜內(nèi)愈合反應(yīng)強(qiáng)烈，炎癥細(xì)胞浸潤，膠原增生，與新生血管相關(guān)的因子VEGF、MMP-2、TGF-b等的表達(dá)均明顯增強(qiáng)。Ad-VEGF165轉(zhuǎn)基因細(xì)胞再生絲素膜植入可以誘導(dǎo)角膜新生血管形成，新生血管維持1月

6、以上。③測序顯示hIL-17F序列正確，RT-PCR和間接免疫熒光法檢測到了QBI-293A細(xì)胞IL-17F的表達(dá)。Ad-hIL-17F能抑制ECV304細(xì)胞的生長，Ad-hIL-17F抑制ECV304細(xì)胞中VEGF的轉(zhuǎn)錄和VEGF、Ang-1基因的表達(dá)。兔眼結(jié)膜下注射Ad-hIL-17F能夠有效抑制由Ad-VEGF165轉(zhuǎn)基因細(xì)胞再生絲素膜誘導(dǎo)的角膜新生血管，同時(shí)沒有角膜穿孔、眼內(nèi)炎癥等不良反應(yīng)。
　　 結(jié)論：⑴再生絲素膜與角

7、膜組織生物相容性良好，再生絲素膜不能上調(diào)與血管新生有關(guān)的細(xì)胞因子表達(dá)。兔眼植入再生絲素膜不能引起角膜血管化，其原因與再生絲素膜在角膜內(nèi)生物相容性良好，不能啟動(dòng)新生血管的進(jìn)程有關(guān)。⑵攜帶Ad-VEGF165轉(zhuǎn)基因HCECs再生絲素膜兔眼植入，角膜基質(zhì)內(nèi)VEGF、MMP-2、TGF-b、CD34等表達(dá)效應(yīng)均增加。利用再生絲素材料細(xì)胞黏附性好的特點(diǎn)，將細(xì)胞固化在材料表面，通過基因轉(zhuǎn)染的方法，使促血管形成的因子在體內(nèi)持續(xù)表達(dá)，從而在局部組織形成