乳腺癌組織學(xué)分級(jí)特征基因提取及基因集富集分析.pdf

1、乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,而且也是婦女惡性腫瘤主要的死亡因?yàn)橹弧Ｈ橄侔┒喟l(fā)于西方歐美國(guó)家,盡管死亡率已經(jīng)逐漸得到控制并有所下降,但發(fā)病率一直居高不下。近年來,原為乳腺癌低發(fā)區(qū)的亞洲國(guó)家發(fā)病率也呈逐年升高的趨勢(shì)。乳腺癌嚴(yán)重威脅著婦女的健康,但乳腺癌病因相當(dāng)復(fù)雜,與遺傳因素、激素、免疫及各種環(huán)境因素(理化、生物因子、生活方式等)有關(guān)。
　　 影響乳腺癌的預(yù)后因素很多,從病理角度分析,腫瘤的組織病理學(xué)類型和組織學(xué)分級(jí)是重要的

2、預(yù)后因素。由于乳腺癌組織學(xué)分級(jí)能夠提供重要的預(yù)后信息,在臨床上早已得到醫(yī)學(xué)工作者的認(rèn)可。目前應(yīng)用得最廣泛的乳腺癌分級(jí)方法是B-R分級(jí),也被稱為諾丁漢分級(jí)系統(tǒng)。這個(gè)分級(jí)方法以腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)特征作為評(píng)價(jià)依據(jù),綜合腺管形成的程度、細(xì)胞核的多形性和核分裂計(jì)數(shù)3個(gè)方面的得分,將乳腺癌分為Ⅰ級(jí)(G1,高分化,生長(zhǎng)慢),Ⅱ級(jí)(G2,中分化),Ⅲ級(jí)(G3,低分化,高度增生)惡性腫瘤。對(duì)大量病人進(jìn)行的多變量分析表明,未治療G1病人的5年生存率為

3、95％,而G2和G3的乳腺癌5年生存率則分別只有75％和50％。
　　 腫瘤的基因組表達(dá)模式反映了腫瘤的生物學(xué)特性,基因表達(dá)譜可用于區(qū)分無法用病理學(xué)方法區(qū)別的腫瘤類型,為乳腺癌的生物學(xué)研究和預(yù)后提供了一種全新的方法。通過基因芯片表達(dá)數(shù)據(jù)可以獲得與乳腺癌組織學(xué)分級(jí)相關(guān)的分類特征,實(shí)現(xiàn)乳腺癌的正確組織學(xué)分類,為乳腺癌的診斷和預(yù)后提供可靠的預(yù)測(cè)依據(jù)。已有研究者利用基因芯片分析獲得了乳腺癌預(yù)后的標(biāo)記基因,這種方法比傳統(tǒng)的預(yù)后標(biāo)記能更準(zhǔn)確

4、地判斷乳腺癌的預(yù)后,且在隨后的實(shí)驗(yàn)中也進(jìn)一步證實(shí)了結(jié)果的可靠性。然而,這些研究還存在缺陷,即預(yù)測(cè)和驗(yàn)證都采用同一組數(shù)據(jù),進(jìn)一步驗(yàn)證也沒有采用其他數(shù)據(jù)集。另外,基因芯片表達(dá)譜中許多被測(cè)基因與樣本的區(qū)分沒有很大關(guān)系。在分類問題中引入這些不必要的基因,將增加分類問題中樣本的維數(shù),導(dǎo)致計(jì)算復(fù)雜度的增加,同時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生一些不必要的噪聲數(shù)據(jù)。如果存在能將兩類區(qū)分開的較小的基因子集,將有利于生物醫(yī)學(xué)工作者專門研究這些基因的功能,了解其生物意義,開發(fā)基

5、于這些基因的價(jià)格低廉的癌癥診斷芯片。因此,特征提取是DNA微陣列研究的一個(gè)很重要的內(nèi)容,通過特征提取找到足夠少的能夠進(jìn)行有效分類的基因子集是非常必要的。
　　 不同分級(jí)對(duì)應(yīng)于不同的細(xì)胞分化程度,低分化的腫瘤通常預(yù)后更差。腫瘤細(xì)胞的分化程度基于病理上的組織學(xué)分級(jí)分類,雖然低分化的腫瘤預(yù)后更差,然而其中的分子機(jī)制卻仍然不清楚。腫瘤細(xì)胞具有無限增殖維持腫瘤克隆生長(zhǎng)的能力,這與干細(xì)胞最重要的特性之一--自我更新能力存在著驚人的相似性,表

6、明腫瘤可能起源于正常干細(xì)胞或者其祖細(xì)胞。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多致癌基因可以干擾正常細(xì)胞的分化,這些基因同樣也可以影響腫瘤細(xì)胞的分化。因此,控制干細(xì)胞功能的某些調(diào)控網(wǎng)絡(luò),可能在某些腫瘤中也同樣發(fā)揮作用。我們通過對(duì)不同分化程度乳腺癌基因表達(dá)譜的基因集富集分析,以期發(fā)現(xiàn)不同分化程度的乳腺癌的基因表達(dá)差異,并能用于改善乳腺癌組織學(xué)的分級(jí),從而更好地了解腫瘤細(xì)胞分化的分子機(jī)制及與正常胚胎干細(xì)胞是否存在聯(lián)系。
　　 研究?jī)?nèi)容主要分為三個(gè)部分:

7、r>　　 第一部分:芯片數(shù)據(jù)質(zhì)量控制
　　 從NCBI共享數(shù)據(jù)庫(kù)GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載乳腺癌相關(guān)的基因芯片數(shù)據(jù),登錄號(hào)為GSE2109、GSE5460、GSE1456和GSE3494。用dChip對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理,以總熒光強(qiáng)度為中位數(shù)的芯片為基準(zhǔn),對(duì)所有芯片進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,以PM/MM模式均一化各芯片中所有基因的表達(dá)水平。同時(shí),對(duì)有污染的芯片進(jìn)行校正,還原原始芯片掃描圖像

8、,生成芯片質(zhì)量報(bào)告。根據(jù)探針污染率和探針交叉雜交率判別芯片的質(zhì)量,將校正后探針交叉雜交和污染仍大于5％的樣本分樣本和臨床數(shù)據(jù)缺失的樣本排除在下一步分析之外。共有676個(gè)乳腺癌芯片樣本達(dá)到質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn),可以用于后期的數(shù)據(jù)分析,GSE2109、GSE5460、GSE1456和GSE3494分別有186、109、147和234個(gè)樣本。
　　 表達(dá)譜的基因表達(dá)值以2為底進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換,選擇PM-only模式分析得出各芯片中所有基因的表達(dá)水平,

9、隨后按以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行過濾:0.5<標(biāo)準(zhǔn)差<1000；在>=80％樣本中表達(dá)水平>=7.00,P call>=80％。過濾后共獲得4800個(gè)探針,輸出基因×樣本的原始表達(dá)值的txt文件。用經(jīng)驗(yàn)貝葉斯方法對(duì)不同GSE的芯片樣本進(jìn)行校正,以消除不同批次的影響造成的數(shù)據(jù)偏差。然后用jusvsn方法對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行微陣列探針?biāo)綌?shù)據(jù)的變異穩(wěn)定化和校正處理,并通過生成散點(diǎn)圖、箱式圖和中值平滑圖將數(shù)據(jù)可視化,檢查歸一化的效果。結(jié)果表明,經(jīng)過芯片數(shù)據(jù)預(yù)處理

10、,較好地消除了兩組芯片數(shù)據(jù)之間的差異,樣本間偏差不明顯,可以進(jìn)行更深一步的分析。
　　 第二部分:乳腺癌組織學(xué)分級(jí)特征基因的獲得
　　 在開源統(tǒng)計(jì)學(xué)語(yǔ)言R2.9.0的環(huán)境下,讀入經(jīng)過濾的芯片表達(dá)值文件,利用Bioconductor中的e1071包,與libsvm連接,用支持向量機(jī)(SVM)學(xué)習(xí)并提取表達(dá)譜中不同組織學(xué)分級(jí)的樣本特征。分別采用線性核函數(shù)(linear)、多項(xiàng)式核函數(shù)(polynomial)、徑向基核函數(shù)(r

11、adial basis,RBF)和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)核函數(shù)(sigmoid)四種不同的核函數(shù),以及c-classification,nu-classification,one-classification,eps-classification和no-classification五種不同的類型來比較分類效果,確定使用的核函數(shù)和類型。從GSE2109和GSE5460合并的表達(dá)譜中分別篩選出不同數(shù)量的特征基因,分別計(jì)算出分類準(zhǔn)確率,確定最佳特征基因數(shù)。

12、用留一法交叉驗(yàn)證(leave-one-out Cross-Validation,LOOCV)對(duì)提取出來的特征進(jìn)行訓(xùn)練和測(cè)試,以判斷測(cè)試數(shù)據(jù)的分類情況。同時(shí),使用pamr方法對(duì)不同的組織學(xué)分級(jí)樣本進(jìn)行分類,和SVM的分類結(jié)果進(jìn)行比較。
　　 將篩選出來的基因作為一個(gè)基因集,生成樣本分類結(jié)果的柱形圖,將分類結(jié)果可視化,檢測(cè)分類效果。用ctree的算法在SVM篩選出來的特征基因中生成預(yù)測(cè)各個(gè)組織學(xué)分級(jí)的基因二分遞歸分割樹；特征基因進(jìn)行

13、KEGG和GO的功能注釋和通路分析。另外,用乳腺癌基因-系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(kù)G2SBC(http://www.itb.cnr.it/breastcancer/index.html)進(jìn)行注釋；并以GSE1456、GSE3494進(jìn)行64個(gè)基因的生存分析。
　　 用參數(shù)為線性核函數(shù)和c-classification的SVM,留一法交叉檢驗(yàn)從經(jīng)過質(zhì)控的芯片表達(dá)譜矩陣提取出64個(gè)特征基因,分類準(zhǔn)確率達(dá)到97.6％,優(yōu)于pamr方法。這些基因中大多數(shù)

14、已經(jīng)被實(shí)驗(yàn)證明在乳腺癌中高表達(dá),有些還可以作為乳腺癌預(yù)后的標(biāo)志基因。
　　 第三部分:乳腺癌細(xì)胞分化基因集富集分析
　　 將表達(dá)值的txt文件轉(zhuǎn)換成表達(dá)譜的gct文件后,與芯片注釋文件、C2和BP基因集文件一起讀入GSEA軟件,根據(jù)樣本對(duì)應(yīng)的臨床信息,生成表型數(shù)據(jù)文件,進(jìn)行基因集富集分析。參數(shù)選擇1000次隨機(jī),基因集范圍大于15個(gè)基因而小于500個(gè)基因,其他參數(shù)均為默認(rèn)值。由于GSEA每次只能分析兩組樣本,因此,將三個(gè)

15、不同組織學(xué)分級(jí)的樣本G1、G2和G3,分別對(duì)應(yīng)于高分化、中分化和低分化,進(jìn)行兩兩比較。將人類胚胎干細(xì)胞相關(guān)的生物學(xué)通路按照GSEA通路的格式,制作成gmt格式的基因集文件。按照上述步驟,將基因集范圍最大值調(diào)整至1500個(gè)基因,其他參數(shù)不變,再用GSEA進(jìn)行ES及增殖相關(guān)通路的基因富集分析。
　　 基因集C2、C5和芯片注釋文件HG_U133_Plus_2從分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(kù)(Molecular Signatures Database

16、,MSigDB)下載。C2包含了KEGG、GenMAPP、BioCarta等已知的基因通路,還包括MSigDB自身構(gòu)建的一些生物通路,每條生物通路對(duì)應(yīng)于一個(gè)基因集。其中,C2包含了1892個(gè)基因集。C5則是來源于GO(gene ontology)數(shù)據(jù)庫(kù)有關(guān)基因本體分析的基因集,本研究?jī)H選用BP基因集進(jìn)行分析。與干細(xì)胞相關(guān)的基因集從已發(fā)表文獻(xiàn)中獲得,其中包括(1)Assou等用統(tǒng)和分析方法收集人類干細(xì)胞表達(dá)譜中高表達(dá)的基因；(2)Boye

17、r等采用CHIP結(jié)合DNA芯片技術(shù)對(duì)SOX2,OCT-4,NANOG三個(gè)重要的胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控靶基因進(jìn)行了全基因組探查,列出分別受三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的所有靶基因；(3)Fernandez等采用生物信息學(xué)結(jié)合CHIP等技術(shù)對(duì)MYC調(diào)控的靶基因進(jìn)行全基因組探查,列出可能受MYC調(diào)控的靶基因集；(4)Ittai Ben-Porath等對(duì)上述兩個(gè)研究的四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子靶基因進(jìn)行收集整理,并通過工具統(tǒng)一轉(zhuǎn)換成EntrezGene ID格式。另外,

18、還有polycomb靶基因,共13個(gè)基因集,7534個(gè)基因。除此之外,還加上了Ittai Ben-Porath等在GO整理出的細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的基因集。
　　 結(jié)論:通過對(duì)來源不同的乳腺癌基因表達(dá)譜分析,提取了64個(gè)與組織學(xué)分級(jí)相關(guān)的特征基因,這種方法可以提高組織學(xué)分級(jí)的準(zhǔn)確率,具有指導(dǎo)預(yù)后的價(jià)值。同時(shí),組織學(xué)分級(jí)與細(xì)胞周期、細(xì)胞分化以及預(yù)后都有著密切的關(guān)系。低分化的乳腺癌細(xì)胞與正常的胚胎干細(xì)胞存在著極高的相似性。這些結(jié)果有助