（1，3）-β-D-葡聚糖檢測(cè)與巢式PCR擴(kuò)增在播散性毛孢子菌病輔助診斷中的意義.pdf

1、研究背景和目的： 繼2000年我國(guó)首例播散性毛孢子菌病病例報(bào)道以來(lái)，播散性毛孢子菌病愈來(lái)愈受到廣泛重視。該病是一種廣泛累及皮膚、肝、脾、肺、腎等器官的系統(tǒng)性真菌病，主要致病菌為阿薩希毛孢子菌?；颊叨嘁虿∏閺?fù)雜、多器官受累、診斷不明和(或)治療不及時(shí)而死亡。由于該病的臨床表現(xiàn)缺乏特異性，其診斷在很大程度上要依靠準(zhǔn)確、特異的輔助檢查。傳統(tǒng)輔助手段包括病原菌培養(yǎng)、鑒定及組織病理檢查等，耗時(shí)長(zhǎng)，至少需1周以上時(shí)間，不僅影響該病的早期診斷

2、和及時(shí)治療，也因?yàn)榕R床上缺乏特異、快速的檢診手段及對(duì)該病的認(rèn)識(shí)不足而易造成誤診誤治。 目前，非培養(yǎng)診斷技術(shù)如真菌成份及代謝產(chǎn)物測(cè)定、特異性DNA片段擴(kuò)增等以其靈敏、快速等優(yōu)點(diǎn)而日益受到關(guān)注。真菌的結(jié)構(gòu)由細(xì)胞壁、隔膜、細(xì)胞膜及有關(guān)細(xì)胞器構(gòu)成，這些結(jié)構(gòu)的組成成份及其代謝產(chǎn)物在真菌的生成和繁殖過(guò)程中，含量及活性也會(huì)有相應(yīng)的變化。(1，3)-β-D-葡聚糖是真菌胞壁的重要組成成分之一，僅在深部真菌感染后經(jīng)吞噬細(xì)胞吞噬后該成分釋放入血，而

3、在淺部真菌感染時(shí)并不釋放，因此對(duì)播散性真菌感染的診斷有重要價(jià)值。分子生物學(xué)方法因其具有較高的敏感度和特異度，近來(lái)在深部真菌感染早期診斷中也倍受關(guān)注。常用的基本的方法包括核酸雜交及擴(kuò)增技術(shù)和巢式PCR等技術(shù)等。 本研究在建立播散性阿薩希毛孢子菌(Trichosporonasahii,T.asahii)感染模型的基礎(chǔ)上，分別對(duì)比觀察了肺泡灌洗液、尿液及血漿的(1，3)-β-D-葡聚糖的含量，同時(shí)采用巢式PCR方法檢測(cè)三種體液標(biāo)本中T

4、.asahiiDNA片段，并與真菌培養(yǎng)方法進(jìn)行比較，試圖從血液之外的其它一些體液中獲得新的、具有診斷意義的標(biāo)本，同時(shí)進(jìn)一步評(píng)價(jià)(1，3)-β-D-葡聚糖檢測(cè)和巢式PCR方法在播散性T.asahii病早期診斷、預(yù)后判斷方面的意義，為研究T.asahii珀勺致病機(jī)理、病程進(jìn)展及治療前景提供重要依據(jù)。 方法和結(jié)果： 1.建立阿薩希毛孢子菌感染動(dòng)物模型Wistar雄性大白鼠45只，隨機(jī)分為三組實(shí)驗(yàn)A組、實(shí)驗(yàn)B組和對(duì)照組(C組)，

5、每組15只。實(shí)驗(yàn)開始第0天，實(shí)驗(yàn)A組和B組大鼠分別尾靜脈接種12×107CFU/ml濃度T.asahii孢子懸液0.8ml，對(duì)照組尾靜脈注射等量生理鹽水。實(shí)驗(yàn)A組在接種第10天后處死，實(shí)驗(yàn)B組及對(duì)照C組在接種第20天后處死。分別采集三組動(dòng)物的肺泡灌洗液、尿液及血漿，一部分作真菌培養(yǎng)，另一部分采用G試驗(yàn)檢測(cè)三種標(biāo)本中(1，3)-β-D-葡聚糖含量，用巢式PCR檢測(cè)體液標(biāo)本中T.asahii特異性DNA片段。同時(shí)采集每只動(dòng)物模型的肝、肺、腎

6、組織，一部分經(jīng)10％甲醛固定、包埋、切片、HE、GMS和PAS染色制片，另一部分制成勻漿送培養(yǎng)。 2.真菌培養(yǎng)結(jié)果組織培養(yǎng)陽(yáng)性率為2％，血漿真菌培養(yǎng)陽(yáng)性率為3.33％，支氣管肺泡灌洗液及尿液真菌培養(yǎng)均為陰性。 3.(1，3)-β-D-葡聚糖檢測(cè)結(jié)果感染動(dòng)物模型血漿、支氣管肺泡灌洗液、尿液標(biāo)本G試驗(yàn)平均敏感性分別為76.67％、80.00％、和10％，其中血漿、支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本G試驗(yàn)結(jié)果與對(duì)照組有顯著差異(P＜0.00

7、1)，尿液標(biāo)本測(cè)試結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；組織培養(yǎng)陽(yáng)性數(shù)較多的動(dòng)物其血漿標(biāo)本(1，3)-β-D-葡聚糖濃度較其它標(biāo)本高，即(1，3)-β-D-葡聚糖濃度與組織臟器感染數(shù)量之間存在正相關(guān)，二者存在線性關(guān)系，為高度相關(guān)(I rI＞0.7，P≤0.05)；感染10d時(shí)三種標(biāo)本(1，3)-β-D-葡聚糖平均濃度到達(dá)峰值，血漿為54.565pg/ml，支氣管肺泡灌洗液為24.508pg/ml，尿液13.117pg/ml，濃度與感染時(shí)間成正比。2

8、0d后各標(biāo)本(1，3)-β-D-葡聚糖濃度下降，血漿為27.077pg/ml；支氣管肺泡灌洗液濃度為21.339pg/ml；尿液為11.748pg/ml，此時(shí)濃度與感染時(shí)間成反比。 4.巢式PCR方法檢測(cè)結(jié)果30只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血漿標(biāo)本巢式PCR平均敏感性為66.67％，支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本平均陽(yáng)性率為43.33％，尿液標(biāo)本為20.00％。其中血漿、支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本敏感性與對(duì)照組比較有顯著差異(P＜0.001)，尿液標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果與

9、對(duì)照組相比提示有差異(0.001＜P＜0.05)。血漿、支氣管肺泡灌洗液巢式PCR方法的陽(yáng)性率與血培養(yǎng)和灌洗液培養(yǎng)結(jié)果比較經(jīng)配對(duì)卡方檢驗(yàn)，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.005)。5.G試驗(yàn)結(jié)果與巢式PCR方法和真菌培養(yǎng)法結(jié)果的對(duì)比30只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血漿標(biāo)本巢式PCR平均陽(yáng)性率為66.67％、G試驗(yàn)為76.67％、真菌培養(yǎng)為3.33％，其中G試驗(yàn)陽(yáng)性率與血培養(yǎng)結(jié)果經(jīng)配對(duì)卡方檢驗(yàn)，二者之間存在顯著差異(X=21.04，P=0.0000且b＞c)，巢

10、式PCR方法的陽(yáng)性率與血培養(yǎng)比亦有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(X1=17.05，P1=0.0005且b＞c)；血漿G試驗(yàn)陽(yáng)性率雖然略高于巢式PCR方法，但兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。支氣管肺泡灌洗液培養(yǎng)全部為陰性；支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本巢式PCR方法平均陽(yáng)性率為43.33％，G試驗(yàn)為80.00％，巢式PCR方法和G試驗(yàn)結(jié)果均與灌洗液真菌培養(yǎng)有顯著差異(P＜0.005)，同時(shí)兩種檢測(cè)方法者之間的陽(yáng)性率也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(X2=9.60，P2=0.0

11、019)。 結(jié)論： 1.與真菌培養(yǎng)相比，G試驗(yàn)和巢式PCR均具有較高敏感性：對(duì)照組三種體液標(biāo)本G試驗(yàn)檢測(cè)均為陰性，提示該試驗(yàn)假陽(yáng)性率低、特異性較高。與血培養(yǎng)方法相比(1，3)-β-D-葡聚糖檢測(cè)具有陽(yáng)性率高、采血量少(0.5-1ml)等優(yōu)點(diǎn)，因而更容易被患者接受。本實(shí)驗(yàn)首次對(duì)支氣管肺泡灌洗液和尿液標(biāo)本中的(1，3)-β-D-葡聚糖進(jìn)行了觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本G試驗(yàn)平均敏感性為80％，較其它標(biāo)本略高。分析原因，

12、一方面肺部是T.asahii的易感部位，另一方面肺泡中存在的大量吞噬細(xì)胞，吞噬病原菌后可能釋放更多的(1，3)-β-D-葡聚糖，這一特性為該疾病的臨床診斷提供了一條新的途經(jīng)。尿液標(biāo)本中G試驗(yàn)敏感性較低，僅為10.00％，且多見(jiàn)于感染臟器數(shù)量較多的動(dòng)物，所以在尿液中檢測(cè)到(1，3)-β-D-葡聚糖，提示感染可能較為嚴(yán)重和廣泛。巢式PCR方法亦在血漿、支氣管灌洗液和尿液標(biāo)本的檢測(cè)中有良好表現(xiàn)，檢測(cè)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)A、B兩組血漿、支氣管肺泡灌洗液

13、標(biāo)本的巢式PCR結(jié)果與對(duì)照組相比均有顯著差異，這些數(shù)據(jù)說(shuō)明巢式PCR方法在檢測(cè)播散性T.asahii感染方面具有較高的敏感性和特異性。實(shí)驗(yàn)中血漿標(biāo)本巢式PCR方法的敏感性顯得尤為突出，更具有臨床應(yīng)用價(jià)值 2.G試驗(yàn)和巢式PCR方法各有特點(diǎn)：雖然G試驗(yàn)和巢式PCR擴(kuò)增均有較高的敏感性和特異性，但二者各有其特點(diǎn)。巢式PCR擴(kuò)增適合于播散性毛孢子菌病菌血癥，而在沒(méi)有菌血癥形成的情況下，G試驗(yàn)則仍具有檢測(cè)意義。因?yàn)镚試驗(yàn)并非如巢式PCR

14、法一樣以菌體DNA片段為目標(biāo)，而是檢測(cè)真菌被吞噬后所釋放的(1，3)-β-D-葡聚糖成分。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物靜脈接種菌液后短期內(nèi)形成菌血癥，此時(shí)標(biāo)本經(jīng)巢式PCR檢測(cè)，陽(yáng)性率很高；一段時(shí)間后，大部分菌體被血液中的白細(xì)胞吞噬、代謝，血液中完整的真菌菌體逐漸變少甚至消失，其DNA被分解破壞，使得血漿巢式PCR方法陽(yáng)性率降低。而未被吞噬的真菌被循環(huán)血液帶到各臟器并逐漸繁殖，再次經(jīng)組織中的噬細(xì)胞所吞噬，(1，3)-β-D-葡聚糖成份釋放入血，恰好被G試驗(yàn)所

15、檢測(cè)到，使得該階段血漿G試驗(yàn)的陽(yáng)性率略高于巢式PCR，所以G試驗(yàn)的可應(yīng)用時(shí)間更長(zhǎng)。然而G試驗(yàn)只能提示深部真菌感染的存在，不能確定是否為毛孢子菌，而菌種的分類恰恰是巢式：PCR方法的優(yōu)勢(shì)所在。 3.(1，3)-β-D-葡聚糖檢測(cè)有助于判斷感染的范圍：(1，3)-β-D-葡聚糖的濃度與組織臟器感染數(shù)量之間存在正相關(guān)，即(1，3)-β-D-葡聚糖濃度越高，組織器官感染的數(shù)量越多。經(jīng)組織病理切片證實(shí)，(1，3)-β-D-葡聚糖濃度值越高

16、的大鼠，病理組織切片上亦顯示越多的微膿瘍和組織破壞。值得一提的是，雖然組織培養(yǎng)總陽(yáng)性率較低，但其中腎臟組織培養(yǎng)的陽(yáng)性率相對(duì)較高，這一點(diǎn)與國(guó)外報(bào)道中腎臟中T.asahii毛孢子菌的清除率最低相吻合，因此對(duì)腎臟的觀察應(yīng)引起今后研究的重視。 4.(1，3)-β-D-葡聚糖檢測(cè)有助于判斷感染的轉(zhuǎn)歸：(1，3)-β-D-葡聚糖檢測(cè)有助于判斷感染的轉(zhuǎn)歸感染的不同時(shí)期(1，3)-β-D-葡聚糖濃度亦有相應(yīng)的變化。接種初期在免疫抑制的條件下真菌

17、大量繁殖，(1，3)-β-D-葡聚糖釋放量急劇上升，10d后隨著機(jī)體免疫力逐漸恢復(fù)，吞噬細(xì)胞對(duì)病原菌的吞噬能力逐漸增強(qiáng)，真菌在血液循環(huán)中的數(shù)量迅速減少，但由于感染組織中葡聚糖的釋放在一定程度上彌補(bǔ)了血漿本身(1，3)-β-D-葡聚糖釋放的減少，使得(1，3)-β-D-葡聚糖濃度呈緩慢下降的趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，真菌接種兩周后，大鼠飲食、活動(dòng)和反應(yīng)能力顯著好轉(zhuǎn)，與(1，3)-β-D-葡聚糖濃度改變一致。所以，動(dòng)態(tài)觀察(1，3)-β-D-葡聚