（1，3）-β-D-葡聚糖檢測與巢式PCR擴增在播散性毛孢子菌病輔助診斷中的意義.pdf

1、研究背景和目的： 繼2000年我國首例播散性毛孢子菌病病例報道以來，播散性毛孢子菌病愈來愈受到廣泛重視。該病是一種廣泛累及皮膚、肝、脾、肺、腎等器官的系統(tǒng)性真菌病，主要致病菌為阿薩希毛孢子菌。患者多因病情復(fù)雜、多器官受累、診斷不明和(或)治療不及時而死亡。由于該病的臨床表現(xiàn)缺乏特異性，其診斷在很大程度上要依靠準(zhǔn)確、特異的輔助檢查。傳統(tǒng)輔助手段包括病原菌培養(yǎng)、鑒定及組織病理檢查等，耗時長，至少需1周以上時間，不僅影響該病的早期診斷

2、和及時治療，也因為臨床上缺乏特異、快速的檢診手段及對該病的認(rèn)識不足而易造成誤診誤治。 目前，非培養(yǎng)診斷技術(shù)如真菌成份及代謝產(chǎn)物測定、特異性DNA片段擴增等以其靈敏、快速等優(yōu)點而日益受到關(guān)注。真菌的結(jié)構(gòu)由細(xì)胞壁、隔膜、細(xì)胞膜及有關(guān)細(xì)胞器構(gòu)成，這些結(jié)構(gòu)的組成成份及其代謝產(chǎn)物在真菌的生成和繁殖過程中，含量及活性也會有相應(yīng)的變化。(1，3)-β-D-葡聚糖是真菌胞壁的重要組成成分之一，僅在深部真菌感染后經(jīng)吞噬細(xì)胞吞噬后該成分釋放入血，而

3、在淺部真菌感染時并不釋放，因此對播散性真菌感染的診斷有重要價值。分子生物學(xué)方法因其具有較高的敏感度和特異度，近來在深部真菌感染早期診斷中也倍受關(guān)注。常用的基本的方法包括核酸雜交及擴增技術(shù)和巢式PCR等技術(shù)等。 本研究在建立播散性阿薩希毛孢子菌(Trichosporonasahii,T.asahii)感染模型的基礎(chǔ)上，分別對比觀察了肺泡灌洗液、尿液及血漿的(1，3)-β-D-葡聚糖的含量，同時采用巢式PCR方法檢測三種體液標(biāo)本中T

4、.asahiiDNA片段，并與真菌培養(yǎng)方法進行比較，試圖從血液之外的其它一些體液中獲得新的、具有診斷意義的標(biāo)本，同時進一步評價(1，3)-β-D-葡聚糖檢測和巢式PCR方法在播散性T.asahii病早期診斷、預(yù)后判斷方面的意義，為研究T.asahii珀勺致病機理、病程進展及治療前景提供重要依據(jù)。 方法和結(jié)果： 1.建立阿薩希毛孢子菌感染動物模型Wistar雄性大白鼠45只，隨機分為三組實驗A組、實驗B組和對照組(C組)，

5、每組15只。實驗開始第0天，實驗A組和B組大鼠分別尾靜脈接種12×107CFU/ml濃度T.asahii孢子懸液0.8ml，對照組尾靜脈注射等量生理鹽水。實驗A組在接種第10天后處死，實驗B組及對照C組在接種第20天后處死。分別采集三組動物的肺泡灌洗液、尿液及血漿，一部分作真菌培養(yǎng)，另一部分采用G試驗檢測三種標(biāo)本中(1，3)-β-D-葡聚糖含量，用巢式PCR檢測體液標(biāo)本中T.asahii特異性DNA片段。同時采集每只動物模型的肝、肺、腎

6、組織，一部分經(jīng)10％甲醛固定、包埋、切片、HE、GMS和PAS染色制片，另一部分制成勻漿送培養(yǎng)。 2.真菌培養(yǎng)結(jié)果組織培養(yǎng)陽性率為2％，血漿真菌培養(yǎng)陽性率為3.33％，支氣管肺泡灌洗液及尿液真菌培養(yǎng)均為陰性。 3.(1，3)-β-D-葡聚糖檢測結(jié)果感染動物模型血漿、支氣管肺泡灌洗液、尿液標(biāo)本G試驗平均敏感性分別為76.67％、80.00％、和10％，其中血漿、支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本G試驗結(jié)果與對照組有顯著差異(P＜0.00

7、1)，尿液標(biāo)本測試結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)意義；組織培養(yǎng)陽性數(shù)較多的動物其血漿標(biāo)本(1，3)-β-D-葡聚糖濃度較其它標(biāo)本高，即(1，3)-β-D-葡聚糖濃度與組織臟器感染數(shù)量之間存在正相關(guān)，二者存在線性關(guān)系，為高度相關(guān)(I rI＞0.7，P≤0.05)；感染10d時三種標(biāo)本(1，3)-β-D-葡聚糖平均濃度到達峰值，血漿為54.565pg/ml，支氣管肺泡灌洗液為24.508pg/ml，尿液13.117pg/ml，濃度與感染時間成正比。2

8、0d后各標(biāo)本(1，3)-β-D-葡聚糖濃度下降，血漿為27.077pg/ml；支氣管肺泡灌洗液濃度為21.339pg/ml；尿液為11.748pg/ml，此時濃度與感染時間成反比。 4.巢式PCR方法檢測結(jié)果30只實驗動物血漿標(biāo)本巢式PCR平均敏感性為66.67％，支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本平均陽性率為43.33％，尿液標(biāo)本為20.00％。其中血漿、支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本敏感性與對照組比較有顯著差異(P＜0.001)，尿液標(biāo)本檢測結(jié)果與

9、對照組相比提示有差異(0.001＜P＜0.05)。血漿、支氣管肺泡灌洗液巢式PCR方法的陽性率與血培養(yǎng)和灌洗液培養(yǎng)結(jié)果比較經(jīng)配對卡方檢驗，有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.005)。5.G試驗結(jié)果與巢式PCR方法和真菌培養(yǎng)法結(jié)果的對比30只實驗動物血漿標(biāo)本巢式PCR平均陽性率為66.67％、G試驗為76.67％、真菌培養(yǎng)為3.33％，其中G試驗陽性率與血培養(yǎng)結(jié)果經(jīng)配對卡方檢驗，二者之間存在顯著差異(X=21.04，P=0.0000且b＞c)，巢

10、式PCR方法的陽性率與血培養(yǎng)比亦有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(X1=17.05，P1=0.0005且b＞c)；血漿G試驗陽性率雖然略高于巢式PCR方法，但兩者無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。支氣管肺泡灌洗液培養(yǎng)全部為陰性；支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本巢式PCR方法平均陽性率為43.33％，G試驗為80.00％，巢式PCR方法和G試驗結(jié)果均與灌洗液真菌培養(yǎng)有顯著差異(P＜0.005)，同時兩種檢測方法者之間的陽性率也存在統(tǒng)計學(xué)差異(X2=9.60，P2=0.0

11、019)。 結(jié)論： 1.與真菌培養(yǎng)相比，G試驗和巢式PCR均具有較高敏感性：對照組三種體液標(biāo)本G試驗檢測均為陰性，提示該試驗假陽性率低、特異性較高。與血培養(yǎng)方法相比(1，3)-β-D-葡聚糖檢測具有陽性率高、采血量少(0.5-1ml)等優(yōu)點，因而更容易被患者接受。本實驗首次對支氣管肺泡灌洗液和尿液標(biāo)本中的(1，3)-β-D-葡聚糖進行了觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本G試驗平均敏感性為80％，較其它標(biāo)本略高。分析原因，

12、一方面肺部是T.asahii的易感部位，另一方面肺泡中存在的大量吞噬細(xì)胞，吞噬病原菌后可能釋放更多的(1，3)-β-D-葡聚糖，這一特性為該疾病的臨床診斷提供了一條新的途經(jīng)。尿液標(biāo)本中G試驗敏感性較低，僅為10.00％，且多見于感染臟器數(shù)量較多的動物，所以在尿液中檢測到(1，3)-β-D-葡聚糖，提示感染可能較為嚴(yán)重和廣泛。巢式PCR方法亦在血漿、支氣管灌洗液和尿液標(biāo)本的檢測中有良好表現(xiàn)，檢測結(jié)果顯示實驗A、B兩組血漿、支氣管肺泡灌洗液

13、標(biāo)本的巢式PCR結(jié)果與對照組相比均有顯著差異，這些數(shù)據(jù)說明巢式PCR方法在檢測播散性T.asahii感染方面具有較高的敏感性和特異性。實驗中血漿標(biāo)本巢式PCR方法的敏感性顯得尤為突出，更具有臨床應(yīng)用價值 2.G試驗和巢式PCR方法各有特點：雖然G試驗和巢式PCR擴增均有較高的敏感性和特異性，但二者各有其特點。巢式PCR擴增適合于播散性毛孢子菌病菌血癥，而在沒有菌血癥形成的情況下，G試驗則仍具有檢測意義。因為G試驗并非如巢式PCR

14、法一樣以菌體DNA片段為目標(biāo)，而是檢測真菌被吞噬后所釋放的(1，3)-β-D-葡聚糖成分。實驗動物靜脈接種菌液后短期內(nèi)形成菌血癥，此時標(biāo)本經(jīng)巢式PCR檢測，陽性率很高；一段時間后，大部分菌體被血液中的白細(xì)胞吞噬、代謝，血液中完整的真菌菌體逐漸變少甚至消失，其DNA被分解破壞，使得血漿巢式PCR方法陽性率降低。而未被吞噬的真菌被循環(huán)血液帶到各臟器并逐漸繁殖，再次經(jīng)組織中的噬細(xì)胞所吞噬，(1，3)-β-D-葡聚糖成份釋放入血，恰好被G試驗所

15、檢測到，使得該階段血漿G試驗的陽性率略高于巢式PCR，所以G試驗的可應(yīng)用時間更長。然而G試驗只能提示深部真菌感染的存在，不能確定是否為毛孢子菌，而菌種的分類恰恰是巢式：PCR方法的優(yōu)勢所在。 3.(1，3)-β-D-葡聚糖檢測有助于判斷感染的范圍：(1，3)-β-D-葡聚糖的濃度與組織臟器感染數(shù)量之間存在正相關(guān)，即(1，3)-β-D-葡聚糖濃度越高，組織器官感染的數(shù)量越多。經(jīng)組織病理切片證實，(1，3)-β-D-葡聚糖濃度值越高

16、的大鼠，病理組織切片上亦顯示越多的微膿瘍和組織破壞。值得一提的是，雖然組織培養(yǎng)總陽性率較低，但其中腎臟組織培養(yǎng)的陽性率相對較高，這一點與國外報道中腎臟中T.asahii毛孢子菌的清除率最低相吻合，因此對腎臟的觀察應(yīng)引起今后研究的重視。 4.(1，3)-β-D-葡聚糖檢測有助于判斷感染的轉(zhuǎn)歸：(1，3)-β-D-葡聚糖檢測有助于判斷感染的轉(zhuǎn)歸感染的不同時期(1，3)-β-D-葡聚糖濃度亦有相應(yīng)的變化。接種初期在免疫抑制的條件下真菌

17、大量繁殖，(1，3)-β-D-葡聚糖釋放量急劇上升，10d后隨著機體免疫力逐漸恢復(fù)，吞噬細(xì)胞對病原菌的吞噬能力逐漸增強，真菌在血液循環(huán)中的數(shù)量迅速減少，但由于感染組織中葡聚糖的釋放在一定程度上彌補了血漿本身(1，3)-β-D-葡聚糖釋放的減少，使得(1，3)-β-D-葡聚糖濃度呈緩慢下降的趨勢。實驗觀察發(fā)現(xiàn)，真菌接種兩周后，大鼠飲食、活動和反應(yīng)能力顯著好轉(zhuǎn)，與(1，3)-β-D-葡聚糖濃度改變一致。所以，動態(tài)觀察(1，3)-β-D-葡聚