JAK-STAT3通路與MAPK通路協(xié)同調(diào)節(jié)早期炎癥介質(zhì)TNF-α轉(zhuǎn)錄活性.pdf

1、在膿毒癥的早期，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)通路分別被直接和間接的激活。MAPK通路是真核細胞介導(dǎo)細胞外信號到細胞內(nèi)反應(yīng)的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)；Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK/STAT)通路是膿毒癥中重要的信號通路之一，參與多種重要炎癥因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控。在機體的膿毒性反應(yīng)中內(nèi)毒素(脂多糖，LPS)起觸發(fā)劑的作用，它激活MAPK通路后，腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素β(IL

2、-1β)等多種炎性細胞因子大量生成，其具體機制已基本清楚。其中TNF-α作為一種重要的早期炎癥介質(zhì)，又間接激活JAK/STAT途徑，STATs活化后直接進入核內(nèi)參與LPS誘導(dǎo)的基因表達。在這一病理過程中，STAT3被激活，晚期炎癥介質(zhì)-高遷移率族蛋白B1(HMGB1)合成和釋放增加，這兩者均可引起TNF-α的表達增強，但其具體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制仍不清楚。許多資料表明，參與膿毒癥的信號通路之間存在著復(fù)雜的交匯作用，其中STAT3蛋白序列中含有簡

3、單、高度保守的MAPK磷酸化位點；而細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、c-Jun氨基未端激酶(JNK)和p38都可以磷酸化STAT3的727位絲氨酸位點，其中ERK1/2和p38與STAT3密切相關(guān)。因此，一方面我們假設(shè)ERK2與p38和STAT3之間存在相互作用，并在LPS介導(dǎo)TNF-α的基因表達方面具有調(diào)節(jié)作用；另一方面，本研究擬進一步探討STAT3和HMGB1在TNF-α啟動子的作用位點，為深入認識HMGB1相關(guān)信號通路的分子基礎(chǔ)

4、及其干預(yù)途徑提供理論依據(jù)。 為了驗證第一方面的假設(shè)，我們應(yīng)用免疫共沉淀的方法對p38與STAT3、ERK2與STAT3的結(jié)合情況進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p38與STAT3、ERK2與STAT3在體內(nèi)均存在相互作用。在此基礎(chǔ)上，我們對這種相互作用在LPS介導(dǎo)TNF-α基因表達中的機制進行了探討。 為了進行免疫共沉淀實驗，首先將人的p38和ERK2利用特異性引物擴增得到，并將其克隆到帶有HA標簽的pcDNA3載體上。然后將Fl

5、ag-STAT3分別和HA-p38與HA-ERK2質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細胞后，將細胞裂解并進行免疫共沉淀。結(jié)果證實，在細胞的上清中用抗Flag抗體偶合磁珠檢測到STAT3蛋白表達，其后使用抗HA抗體分別檢測到p38/ERK2蛋白表達，說明STAT3蛋白與p38/ERK2蛋白在體內(nèi)存在相互作用，為下一步實驗奠定了基礎(chǔ)。 在將HA-p38和Flag-STAT3與TNF-α啟動子全長報告基因共同轉(zhuǎn)染293T細胞后，檢測它們是否共同協(xié)調(diào)

6、TNF-α啟動子的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p38和STAT3在刺激前后不僅單獨可以調(diào)節(jié)TNF-α啟動子的活性，而且可以協(xié)同調(diào)節(jié)其活性；在將HA-ERK2和Flag-STAT3與TNF-α啟動子全長報告基因共同轉(zhuǎn)染293T細胞后，檢測它們是否共同協(xié)調(diào)TNF-α啟動子的活性。結(jié)果顯示。ERK2和STAT3在刺激前后不僅單獨可以調(diào)節(jié)TNF-α啟動子的活性，而且可以協(xié)同調(diào)節(jié)其活性。 在RNA干擾實驗中觀察如果阻斷STAT3通路，p38/ERK2

7、和STAT3的協(xié)同作用將被降低，TNF-α的合成將隨之減少。為了證實這一想法，將STAT3的干擾質(zhì)粒與p38/ERK2和STAT3質(zhì)粒混合物共同轉(zhuǎn)染細胞，進行TNF-α啟動子全長報告基因的活性檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如果應(yīng)用STAT3的干擾RNA抑制STAT3的表達，p38/ERK2和STAT3對TNF-α的協(xié)同效應(yīng)將被抑制。 為了探討STAT3在TNF-α啟動子的作用位點，我們首先將Flag-STAT3與全長TNF-α啟動子報告基因共

8、同轉(zhuǎn)染COS-7細胞，觀察STAT3作用的劑量-效應(yīng)。結(jié)果證實，STAT3對TNF-α基因的表達不受LPS調(diào)節(jié)，無論是否有LPS刺激，隨著STAT3劑量的增加，TNF-α基因的表達亦隨之增加。在將200 ng/ml濃度的Flag-STAT3質(zhì)粒分別和不同長度的TNF-α啟動子報告基因質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染COS-7細胞并用LPS刺激，觀察不同片段的TNF-α啟動子活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，95 bp片段的TNF-α缺失突變體作用最明顯，增加了6.9倍。其次

9、，我們分別構(gòu)建了70 bp、75 bp、80 bp和85 bp片段的TNF-α缺失突變體-pTNF-α(70 bp)、pTNF-α(75 bp)、pTNF-α(80 bp)和pTNF-α(85 bp)，并將它們與Flag-STAT3共同轉(zhuǎn)染COS-7細胞并用LPS刺激，觀察到85 bp片段的活性與95 bp片段相似，當片段到達80 bp時，活性降低到對照水平。為了進一步了解其精確結(jié)合位點，我們將85 bp片段突變體的81和82位堿基突變

10、，檢測其對TNF-α活性影響，發(fā)現(xiàn)啟動子活性下降。最后，為了證明STAT3的潛在結(jié)合位點在80 bp到85 bp之間，且81和82位這兩個位點的突變確實改變了STAT3對TNF-α啟動子活性，我們進行凝膠遷移阻滯實驗，觀察到TNF-α啟動子62-85 bp的野生型γ-p32標記的探針可以與核蛋白STAT3結(jié)合，而突變的62-85 bp標記的探針不能與核蛋白STAT3結(jié)合。 在探討HMGB1在TNF-α啟動子的作用位點實驗中，我們

11、首先將人的HMGB1構(gòu)建到帶有HA標簽的pcDNA3載體上。其次，HA-HMGB1與全長TNF-α啟動子報告基因共同轉(zhuǎn)染COS-7細胞并用LPS刺激，觀察HMGB1作用的劑量-效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著HMGB1從100 ng/ml增加到1500 ng/ml，TNF-α啟動子的活性先增加后降低。在將300 ng/ml HMGB1與不同片段TNF-α報告基因共同轉(zhuǎn)染細COS-7細胞并用LPS刺激后，發(fā)現(xiàn)在啟動子95-120堿基之間的一個經(jīng)典的內(nèi)

12、毒素作用位點NF-IL6位點可能是HMGB1作用于TNF-α啟動子的主要作用部位。 通過上述研究可以得出以下結(jié)論： 1．STAT3和p38/ERK2蛋白在體內(nèi)存在相互作用。 2．在LPS刺激下，STAT3與p38、STAT3與ERK2均對TNF-α的表達發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)。 3．在阻斷STAT3通路后，STAT3與p38、STAT3與ERK2對TNF-α表達的協(xié)同效應(yīng)將明顯降低。 4．STAT3對TNF