JAK2-STAT3通路對(duì)結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞侵襲遷移的影響及機(jī)制研究.pdf

1、背景及目的:
　　 結(jié)腸癌是常見的惡性腫瘤,發(fā)病率逐年上升,且預(yù)后較差,約有90％的病人死于腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)。目前認(rèn)為腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的過程包括:腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫離,穿過基底膜細(xì)胞外基質(zhì),遷移到周圍血管和淋巴管,到達(dá)遠(yuǎn)處器官后與內(nèi)皮細(xì)胞粘附,侵出血管外定植,形成轉(zhuǎn)移灶。在上述過程中,許多細(xì)胞因子在不同階段發(fā)揮重要作用,影響腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。大量研究證實(shí)表皮生長(zhǎng)因子/受體(EGF/EGFR)與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),是近年研

2、究的熱點(diǎn)。EGFR屬于跨膜受體酪氨酸蛋白激酶,活化的EGFR可激活細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)通路,包括Ras/Raf/MAPK,PI3K/Akt,JAK/STAT等。其中JAK2-STAT3(Janus kinase2-signal transducer and activator of transcription3)是近來頗受關(guān)注的一條信號(hào)傳導(dǎo)通路。JAK2結(jié)合到相應(yīng)的膜受體上,使受體的酪氨酸活化,暴露結(jié)合STAT3位點(diǎn),然后JAK2磷酸化STA

3、T3的酪氨酸。磷酸化STAT3(P-STAT3)形成二聚體進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),與靶基因結(jié)合,調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、抗凋亡、腫瘤血管生成和免疫逃疫等功能。研究發(fā)現(xiàn)STAT3還能調(diào)控細(xì)胞中E-鈣粘蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)的表達(dá),而這兩種蛋白與腫瘤細(xì)胞間的粘附和腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)功能有關(guān)。STAT3的異常表達(dá)和活化在乳腺癌、前列腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤中被發(fā)現(xiàn),能明顯促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。鑒于以上研究,我們推測(cè)表皮生長(zhǎng)因子可能通

4、過激活JAK2-STAT3通路調(diào)節(jié)E-cadherin和Vimentin表達(dá),從而促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲遷移。為此,本研究先在結(jié)腸癌組織中檢測(cè)STAT3、E-cadherin和Vimentin表達(dá),探討其與結(jié)腸癌臨床病理的關(guān)系。然后用EGF和JAK2激酶抑制劑AG490分組處理結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞,研究JAK2/STAT3通路對(duì)結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞E-cadherin和Vimentin表達(dá)及侵襲遷移能力的影響。探討JAK2/STAT3通路在結(jié)

5、腸癌LoVo細(xì)胞侵襲遷移中的作用及機(jī)制,為防治結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移提供客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.收集70例結(jié)腸癌患者的癌組織和癌旁正常結(jié)組織標(biāo)本,應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)STAT3、E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá),系統(tǒng)分析并比較三種蛋白表達(dá)與漿膜受侵、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床病理分期(TNM)、病理分化類型等臨床病理因素的關(guān)系;
　　 2.特異性的JAK2激酶抑制劑AG490設(shè)10、25、50、

6、100、150μmol/L濃度組,分別處理結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞6、12、24、72、48小時(shí),MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖。將結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞分對(duì)照組、EGF組、EGF+AG490組、AG490組,流式細(xì)胞儀檢測(cè)LoVo細(xì)胞的細(xì)胞周期,Western blot檢測(cè)LoVo細(xì)胞中磷酸化STAT3蛋白表達(dá);
　　 3.應(yīng)用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)和Transwell小室檢測(cè)結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞對(duì)照組、EGF組、EGF+AG490組、AG490組的細(xì)胞遷移和

7、侵襲能力,免疫熒光和Western blot檢測(cè)E-cadherin、Vimentin在各組結(jié)腸癌細(xì)胞中的定位及表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.免疫組織化學(xué)檢測(cè)STAT3、E-cadherin、Vimentin在結(jié)腸癌組織中陽性表達(dá)率分別為74.29％,32.86％,78.57％,在癌旁正常組織中為15.71％,82.86％,12.86％。三種蛋白表達(dá)水平與腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)(P＜0.05

8、),而與年齡、性別、腫瘤的大小、部位無關(guān)(P＞0.05)。結(jié)腸癌組織中STAT3與Vimentin表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)(r=0.616,P＜0.01),與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.702,P＜0.01)。
　　 2.AG490抑制結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞增殖作用呈現(xiàn)濃度時(shí)間依賴性,最佳作用濃度、時(shí)間為50μmol/L、24小時(shí)。與對(duì)照組比較,EGF組P-STAT3表達(dá)量明顯上調(diào),細(xì)胞增殖指數(shù)(63.17％±4.25)亦明顯

9、增加(P＜0.01);EGF+AG490組和AG490組P-STAT3表達(dá)量明顯下調(diào)(P＜0.05),細(xì)胞增殖指數(shù)(分別為27.91％±3.16、23.85％±1.07)明顯降低(P＜0.01)。
　　 3.①細(xì)胞劃痕:結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞對(duì)照組、EGF組、EGF+AG490組、AG490組細(xì)胞劃痕愈合面積分別為38％、80％、40％、24％。與對(duì)照組比較,EGF組愈合面積明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);EGF+AG4

10、90組和AG490組面積減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);
　　 ②Transwell:結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞對(duì)照組、EGF組、EGF+AG490組、AG490組LoVo細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)分別為35.24±2.65、55.08±2.14、20.19±3.50、16.52±2.02。與對(duì)照組比較,EGF組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),EGF+AG490組和AG490組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少(P＜0.05)。

11、>　　 ③Westernblot:與對(duì)照組相比,EGF組中E-cadherin表達(dá)顯著降低,同時(shí)Vimentin表達(dá)顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),免疫熒光顯示E-cadherin向胞漿移位,Vimentin在LoVo細(xì)胞胞漿內(nèi)表達(dá);EGF+AG490組和AG490組中E-cadherin表達(dá)顯著增加,而Vimentin表達(dá)減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.STAT3和Vim