5-Fu誘導(dǎo)大鼠肺損傷修復(fù)過(guò)程中Oct3-4表達(dá)及意義.pdf

1、肺干細(xì)胞(lung stem cells)是指能不斷自我更新并在特定條件下分化為功能性肺組織的細(xì)胞。由于肺的上皮結(jié)構(gòu)和細(xì)胞組成非常復(fù)雜，其細(xì)胞種類(lèi)多達(dá)40余種，加上呼吸道上皮具有極低的生長(zhǎng)更新率和十分有限的再生能力，導(dǎo)致對(duì)肺干細(xì)胞的研究進(jìn)展不如其它組織。但是在肺損傷后干細(xì)胞分裂加速，通過(guò)不對(duì)稱(chēng)分裂的方式產(chǎn)生子代干細(xì)胞及各個(gè)組織細(xì)胞的祖細(xì)胞，最終產(chǎn)生終末分化的細(xì)胞以補(bǔ)充受損的細(xì)胞，起到促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)的作用。
　　 近年來(lái)人們相繼發(fā)現(xiàn)

2、多種細(xì)胞在發(fā)育過(guò)程中表現(xiàn)出肺干細(xì)胞特性并在肺損傷修復(fù)中發(fā)揮作用，但是根據(jù)干細(xì)胞定義，很多這類(lèi)細(xì)胞屬于祖細(xì)胞的范疇，而不是真正意義上的肺干細(xì)胞。
　　 我們實(shí)驗(yàn)室曾首次建立了5-Fu引發(fā)離體氣管損傷修復(fù)模型，發(fā)現(xiàn)經(jīng)5-Fu作用后，增殖期氣管上皮細(xì)胞變性、壞死，而殘留在基底膜上的G0期細(xì)胞出現(xiàn)胚胎干細(xì)胞相關(guān)基因Oct3/4、Sox2、Nanog表達(dá)，當(dāng)G0期細(xì)胞出現(xiàn)向基底細(xì)胞、纖毛細(xì)胞、粘液細(xì)胞分化后，Oct3/4、Sox2、Nan

3、og表達(dá)消失。研究證明Oct3/4、Sox2、Nanog陽(yáng)性細(xì)胞為氣管干細(xì)胞。但5-Fu對(duì)遠(yuǎn)端肺上皮損傷修復(fù)過(guò)程中胚胎干細(xì)胞相關(guān)基因Oct3/4變化如何，目前尚無(wú)報(bào)告。
　　 目的:
　　 本研究通過(guò)制備5-Fu誘導(dǎo)肺遠(yuǎn)端上皮粘膜損傷模型，觀察其損傷修復(fù)過(guò)程中的Oct3/4動(dòng)態(tài)變化，為鑒定、分離遠(yuǎn)端肺上皮干細(xì)胞提供新的依據(jù)。
　　 材料與方法:
　　 一、標(biāo)本收集
　　 雌雄不限Wistar大鼠(

4、～200g)購(gòu)于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部25只，隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組：5-Fu損傷后12h組，24h組，48h組，72h組，每組5只，對(duì)照組：未經(jīng)5-Fu處理，共5只。乙醚麻醉后將大鼠固定在支架，行氣管插管至氣管分叉處，利用0.9％生理鹽水將5-Fu配制成5mg/mL，按1Omg/Kg劑量灌注大鼠肺內(nèi)，對(duì)照組注射等劑量的PBS。分別在灌注12h，24h，48h，72h后處死大鼠取新鮮肺部組織。
　　 A549細(xì)胞系來(lái)源于中國(guó)

5、醫(yī)科大學(xué)病理教研室。
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法
　　 將各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的鼠肺組織及正常鼠肺組織收集，一部分用于石蠟包埋切片后行HE染色、間接免疫熒光染色，確定組織損傷后的修復(fù)情況及Oct3/4表達(dá)情況，并用雙重免疫熒光染色觀察Oct3/4核陽(yáng)性細(xì)胞和SP-C、CCSP雙陽(yáng)性細(xì)胞的關(guān)系。將另一部分肺組織收集，進(jìn)行western-blot檢測(cè)，觀察Oct3/4蛋白表達(dá)情況。
　　 在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中，本課題組已經(jīng)通過(guò)體外藥

6、物敏感實(shí)驗(yàn)，得到5-Fu最佳作用濃度為3μl/m1。肺腺癌細(xì)胞按5×105/mL密度接種于100ml培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)的肺腺癌細(xì)胞分為兩組：一組是沒(méi)有藥物作用的肺腺癌細(xì)胞；另一組是經(jīng)過(guò)5-Fu作用后的肺腺癌細(xì)胞，分別進(jìn)行免疫熒光染色和western-blot檢測(cè)，觀察Oct3/4的表達(dá)情況。
　　 所有的免疫熒光實(shí)驗(yàn)和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)三次，所得數(shù)據(jù)的值用均數(shù)(means)±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)來(lái)表示。全部數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS11.5軟件

7、對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，當(dāng)P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 一、5-Fu誘導(dǎo)大鼠肺損傷修復(fù)過(guò)程中遠(yuǎn)端肺上皮細(xì)胞改變及Oct3/4的表達(dá)變化
　　 正常大鼠肺組織在經(jīng)5-Fu打擊12小時(shí)后，出現(xiàn)終末細(xì)支氣管、肺泡上皮細(xì)胞變性、壞死，上皮細(xì)胞減少，開(kāi)始出現(xiàn)Oct3/4核陽(yáng)性表達(dá)，24h后終末細(xì)支氣管、肺泡上皮只剩殘留的少量細(xì)胞，Oct3/4核陽(yáng)性表達(dá)增多，達(dá)到高峰，48h、72h后，終末細(xì)支氣

8、管、肺泡上皮逐漸修復(fù)，恢復(fù)原有肺泡結(jié)構(gòu)形態(tài)，Oct3/4核陽(yáng)性表達(dá)逐漸減少。正常終末細(xì)支氣管、肺泡上皮未檢測(cè)到Oct3/4表達(dá)，上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常。
　　 二、蛋白印跡檢測(cè)大鼠肺泡上皮損傷修復(fù)過(guò)程中Oct3/4蛋白表達(dá)水平
　　 正常終末細(xì)支氣管、肺泡上皮沒(méi)有Oct3/4表達(dá)。5-Fu打擊后12h，出現(xiàn)Oct3/4表達(dá)，在24h達(dá)到高峰，并隨著終末細(xì)支氣管、肺泡上皮細(xì)胞的修復(fù)逐漸增加，Oct3/4隨后逐漸降低，至72h降至

9、正常水平。
　　 三、肺組織Oct3/4核陽(yáng)性表達(dá)位置和SP-C(+)、CCSP(+)雙陽(yáng)性細(xì)胞位置不同。
　　 在5-Fu誘導(dǎo)后Oct3/4核陽(yáng)性表達(dá)最多的時(shí)間點(diǎn)，進(jìn)行雙重免疫熒光染色。結(jié)果顯示Oct3/4核陽(yáng)性的位置和SP-C、CCSP雙陽(yáng)性細(xì)胞處于不同位置。
　　 四、間接免疫熒光及蛋白印跡檢查檢測(cè)5-Fu誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中Oct3/4表達(dá)
　　 未經(jīng)5-Fu處理的肺腺癌A549細(xì)胞系Oct

10、3/4核表達(dá)陰性，經(jīng)5-Fu處理組的A549細(xì)胞系出現(xiàn)Oct3/4核陽(yáng)性表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 1、5-Fu作用前后，終末細(xì)支氣管、肺泡上皮細(xì)胞出現(xiàn)Oct3/4陽(yáng)性表達(dá)有規(guī)律的消長(zhǎng)，正常終末細(xì)支氣管、肺泡上皮細(xì)胞胚胎干細(xì)胞相關(guān)基因Oct3/4陰性，當(dāng)5-Fu作用后，基底膜殘留GO期細(xì)胞出現(xiàn)Oct3/4表達(dá)，并短暫增生，在向Clara細(xì)胞、纖毛細(xì)胞及Ⅰ型、Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞分化時(shí)，Oct3/4再次轉(zhuǎn)陰性。