同種排斥過(guò)程中TLR5及Foxp3的表達(dá)、調(diào)節(jié)及意義.pdf

1、研究目的: 迄今為止的研究表明Treg細(xì)胞具有免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用，TLR5的激活對(duì)某些損傷因素具有免疫保護(hù)作用，Treg細(xì)胞上TLR5/TLR7/8高表達(dá)，但是同種移植狀態(tài)下，TLR5的活化狀態(tài)和活化的調(diào)節(jié)及對(duì)Treg的影響途徑、機(jī)理和信號(hào)傳導(dǎo)途徑尚不清楚。我們推測(cè)利用Flagellin刺激同種移植TLR5活化，可能在體內(nèi)擴(kuò)增Treg的比例，增強(qiáng)Foxp3的表達(dá)，從而達(dá)到形成移植耐受的目的。 本課題首先分析了同種皮膚移植急性

2、排斥過(guò)程中TLR5和Foxp3基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)狀況，然后應(yīng)用Rapa和CsA兩種不同的免疫抑制劑對(duì)小鼠同種皮膚移植模型進(jìn)行耐受初步誘導(dǎo)，研究了Rapa和CsA體內(nèi)應(yīng)用對(duì)TLR5和Foxp3基因表達(dá)的影響及與移植物生存的關(guān)系；研究了Flagellin體外處理對(duì)移植耐受模型中T細(xì)胞及相關(guān)分子TLR5、Foxp3表達(dá)影響及與Rapa和CsA是否與協(xié)同作用；探討了同種移植狀態(tài)下TLR5表達(dá)的變化及意義，探討TLR5和Foxp3表達(dá)的相關(guān)性，旨在闡

3、明Rapa、CsA及Flagellin在同種移植耐受狀態(tài)下，是否能夠通過(guò)激活TLR5，增強(qiáng)Treg的活性，強(qiáng)化免疫耐受的誘導(dǎo)，為利用TLR5特異配體-Flagellin和抗排斥藥物Rapa、CsA聯(lián)合進(jìn)行同種移植耐受誘導(dǎo)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為CD4+CD25+ Treg體外擴(kuò)增和應(yīng)用于臨床防治同種移植排斥反應(yīng)探索新的途徑。 實(shí)驗(yàn)方法: 1.Flagellin的提取和鑒定：利用LB營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基擴(kuò)增甲型副傷寒桿菌，用PBS離心后洗滌

4、按照文獻(xiàn)[25]方法分離粗制鞭毛蛋白（Flagellin），然后通過(guò)Sephacryl S-200凝膠柱分離不同分子量的蛋白質(zhì)，通過(guò)SDS-PAGE觀察并收集目的蛋白（Flagellin），透析過(guò)夜，然后利用抗Flagellin抗體，通過(guò)Western Blot檢測(cè)目的蛋白的特異性。純化的Flagellin溶液經(jīng)紫外分光光度儀測(cè)光密度OD260、OD280值，按照公式計(jì)算蛋白含量，置-20℃儲(chǔ)存。 2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：以B6小鼠為供體

5、，BABL/c小鼠為受體，建立小鼠同種皮膚移植模型。移植后第1天BABL/c小鼠分別給予Rapa（1.5mg/kg）或CsA（10mg/kg）及生理鹽水腹腔注射進(jìn)行耐受誘導(dǎo)，每日1次，連續(xù)14日。移植后第1、7、10、14、21天，分別取實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組小鼠脾臟及移植部位的皮片，采用異硫基氫酸胍（TRIzol）一步法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）對(duì)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，以GAPDH作為對(duì)照，檢測(cè)TLR5及Foxp3mRN

6、A的相對(duì)表達(dá)量。 3.體外實(shí)驗(yàn)：分離純化同種移植后第10天的小鼠脾T細(xì)胞，加入不同濃度的Flagellin處理3、6、12h后測(cè)定TLR5和Foxp3 mRNA的表達(dá)量，探討Flagellin作用的最佳濃度及時(shí)間；進(jìn)而在移植后第10天，提取耐受誘導(dǎo)的BABL/c小鼠脾細(xì)胞（術(shù)后第14天對(duì)照組移植皮片全部排斥）T細(xì)胞，經(jīng)不同濃度Flagellin、Rapa、CsA體外處理后，RT-PCR檢測(cè)TLR5及Foxp3 mRNA的相對(duì)表達(dá)

7、量。同時(shí)選擇未行移植術(shù)的正常BALB/c小鼠T細(xì)胞，經(jīng)不同濃度Flagellin、Rapa、CsA體外處理后，檢測(cè)TLR5及Foxp3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 1.SDS-PAGE顯示在分子量為52kD處有目的蛋白條帶，Western Blot結(jié)果顯示抗鞭毛抗體染色呈陽(yáng)性。表明鞭毛蛋白提取成功。提取的蛋白濃度為75.03μg/ml。 2.與生理鹽水對(duì)照組（12.8±1.6d）相比，同種移植后體內(nèi)應(yīng)用C

8、sA（22.0±1.9d）或Rapa（23.8±2.ld）均可明顯延長(zhǎng)移植皮片的存活期（p<0.05）。Rapa處理組與CsA處理組相比，延長(zhǎng)移植物存活的能力無(wú)明顯差別，但Rapa處理組小鼠生存狀態(tài)比CsA處理組更佳。 3.對(duì)照組同種移植后TLR5和Foxp3的表達(dá)均在排斥高峰期（移植后第10d）升高最明顯，之后Foxp3的表達(dá)迅速下降，而TLR5的表達(dá)持續(xù)到移植后14d才開(kāi)始下降。小鼠皮片急性移植排斥期1、7、10、14、21

9、天，移植受體脾細(xì)胞的TLR5與Foxp3變化趨勢(shì)明顯正相關(guān)。 4.體內(nèi)給予CsA后，TLR5和Foxp3的表達(dá)第7天就明顯升高，第10天達(dá)到高峰，F(xiàn)oxp3在第14天恢復(fù)至起始水平，而TLR5在第21天恢復(fù)至起始水平；與對(duì)照組相比，在同種皮片移植后1、7、10、14、21天，Rapa體內(nèi)處理組脾細(xì)胞TLR5 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)；TLR5表達(dá)量較CsA組和對(duì)照組明顯增多，且停藥后，第21天表達(dá)量仍明顯高于CsA組和對(duì)照組。而Fo

10、xp3的表達(dá)的變化與CsA組無(wú)顯著變化。 5.體外實(shí)驗(yàn)證明：1）Flagellin、Rapa、Flagellin+Rapa、Flagellin+CsA均可促進(jìn)正常BABL/c小鼠T細(xì)胞的TLR5 mRNA明顯高表達(dá)（p<0.05），其中Flagellin+Rapa聯(lián)合處理組增高更明顯，而單獨(dú)用CsA處理組與未處理組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Flagellin處理組、Rapa組、Flagellin+Rapa聯(lián)合處理組、Flagellin+

11、CsA聯(lián)合處理組的Foxp3 mRNA均明顯高表達(dá)（p<0.05），其中Flagellin+Rapa聯(lián)合處理組的變化最明顯。單獨(dú)使用CsA處理組與未處理組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2）經(jīng)不同濃度Flagellin處理急性排斥期小鼠T細(xì)胞不同時(shí)間后發(fā)現(xiàn)，TLR5 mRNA在Flagellin濃度100ng/ml，培養(yǎng)6h表達(dá)最高。Foxp3mRNA在Flagellin濃度1000ng/ml，培養(yǎng)6h表達(dá)最高，且在所研究的各時(shí)間點(diǎn)，F(xiàn)lagelli

12、n均能促進(jìn)Foxp3表達(dá)。3）Flagellin、Flagellin+Rapa、Flagellin+CsA均可促進(jìn)急性排斥期BABL/c小鼠T細(xì)胞的TLR5 mRNA表達(dá)，其中Flagellin+Rapa聯(lián)合組增高更明顯，而單獨(dú)用CsA或Rapa處理組的TLR5 mRNA表達(dá)無(wú)顯著改變。Flagellin、CsA、Rapa、Flagellin+Rapa、Flagellin+CsA聯(lián)合處理均可促進(jìn)Foxp3 mRNA表達(dá)，其中Flagel

13、lin+Rapa聯(lián)合處理組增高更明顯。 結(jié)論: 1.體內(nèi)應(yīng)用Rapa或CsA均可明顯延長(zhǎng)同種移植皮片的存活時(shí)間，Rapa在抑制移植物排斥、改善宿主生存狀態(tài)方面效果明顯優(yōu)于CsA。 2.同種移植急性排斥高峰期，TLR5和Foxp3表達(dá)升高，Rapa可以明顯增強(qiáng)同種移植排斥期TLR5與Foxp3的表達(dá)，尤其是使Foxp3表達(dá)持續(xù)升高，CsA也可促進(jìn)這兩種基因的表達(dá)，但持續(xù)時(shí)間較短。 3.成功提取甲型副傷寒桿菌

14、的鞭毛蛋白并進(jìn)行了初步鑒定。 4.Rapa在體外可促進(jìn)移植耐受模型T細(xì)胞的TLR5和Foxp3的基因表達(dá)，F(xiàn)lagellin可以協(xié)同增強(qiáng)Rapa這一作用。CsA可促進(jìn)排斥高峰期T細(xì)胞Foxp3表達(dá)，但對(duì)TLR5表達(dá)無(wú)明顯影響，與Flagellin無(wú)協(xié)同作用。Flagellin體外可以促進(jìn)排斥高峰期T細(xì)胞TLR5和Foxp3的表達(dá)，并增強(qiáng)Rapa的作用效果。 5.Rapa和Flagellin體外均可促進(jìn)正常小鼠脾T細(xì)胞的T