5-FU致小鼠腸黏膜損傷修復(fù)過程中腸上皮干細胞的作用機制.pdf

1、目的：通過制備不同劑量5-FU致小鼠腸黏膜損傷模型，觀察小腸黏膜的組織學(xué)改變，檢測p糖蛋白1(p-glycoproteinl，p-g-p1)、增殖細胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen，PCNA)和腸上皮干細胞的標(biāo)記物：musashi-1(msi-1)的表達變化，了解5-FU對小腸黏膜的損傷作用，探討腸黏膜損傷修復(fù)過程中腸上皮干細胞的作用機制。同時利用熒光染料Rhodamine123(Rho)對腸上皮

2、細胞進行染色，通過流式細胞儀檢測其染色特征，觀察Rho染色陰性細胞比例在5-FU致腸黏膜損傷修復(fù)過程中的動態(tài)變化，分離不同染色強度的細胞群，研究Rho染色陰性細胞是否具有腸上皮干細胞的特征，探討初步分離、純化腸上皮干細胞的方法。 方法：(1)小劑量5-FU致小鼠腸黏膜損傷模型：成年C57BL/6J小鼠50只，其中40只給予連續(xù)5天腹腔注射5-FU(30mg/kg.d)，另10只腹腔注射等量PBS作為空白對照。于5-FU注射結(jié)束后

3、1d、3d、5d和7d將小鼠剖殺取出中段小腸，光鏡下觀察腸黏膜病理改變；流式細胞術(shù)檢測Rho染色陰性細胞比例變化；RT-PCR檢測msi-1、p-g-p1mRNA表達情況；免疫組化分析msi-1表達陽性細胞數(shù)量及其百分比動態(tài)變化。(2)大劑量5-FU致腸黏膜嚴重損傷模型：成年C57BL/6J小鼠40只，分為對照組(n=8，A組)和處理組(n=32)。A組給予腹腔注射PBS，處理組給予腹腔注射大劑量5-FU(150mg/kg.d×5d)，

4、分別于處理后1d(B組)、3d(C組)、5d(D組)剖殺瀕死小鼠取出小腸，常規(guī)HE染色，免疫組化檢測PCNA和腸上皮干細胞標(biāo)記物msi-1的表達；制備B組小鼠腸黏膜細胞懸液，流式細胞檢測msi-1陽性細胞比例。(3)利用Rho染色初步分離、純化腸上皮干細胞：利用Rho對小鼠腸上皮細胞進行染色，流式細胞儀分選Rho染色陰性和Rho染色強陽性細胞群；RT-PCR檢測Rho染色陰性和Rho強陽性細胞群細胞msi-1和p-g-p1mRNA的表達

5、；流式細胞分析細胞周期和msi-1蛋白表達情況。 結(jié)果：(1)小劑量5-FU作用后，光鏡下可見小鼠腸黏膜萎縮，間質(zhì)有少量中性細胞滲透；與對照組相比較，腸黏膜細胞中Rho陰性細胞比例顯著增高，以處理后1d最高，隨后逐漸下降(19.03±0.34；15.08±0.17；13.94±0.11；12.84±0.231vs.12.18±0.32，P<0.01)；msi-1mRNA表達無明顯變化，p-g-p1mRNA表達略有上升；msi-1

6、陽性細胞數(shù)量略有降低，但無顯著差異(5.70±0.83；5.73±0.87；5.80±0.85；5.97±0.92vs.6.17±0.87，P>0.05)，msi-1表達陽性細胞百分比顯著增高(2.91±0.19；2.39±0.17；2.22±0.20；2.08±0.15vs.2.00±0.16，P<0.01)且與Rho陰性細胞比例呈顯著正相關(guān)(P<0.01，r=0.755)。(2)大劑量5-FU作用后，小鼠腸黏膜被嚴重破壞，黏膜萎縮，

7、絨毛、隱窩結(jié)構(gòu)消失；免疫組化結(jié)果顯示，在正常對照小腸組織中，msi-1主要表達在腸隱窩底部，潘氏細胞上面，大劑量5-FU作用后，與對照組比較，msi-1表達增加，msi-1陽性細胞比例顯著增高(25.15±0.49；21.17±0.37；16.20±0.39vs.2.06±0.13，P<0.01)；PCNA在正常小腸組織中主要表達在腸隱窩中上部分，大劑量5-FU作用后，與對照組比較，PCNA的表達增加，PCNA指數(shù)顯著增高(26.90±

8、1.85；23.50±1.51；17.32±1.04vs.16.02±0.84，P<0.01)；流式檢測提示，根據(jù)細胞體積大小，B組小鼠腸黏膜細胞可分為兩群，其中前向角(FSC)數(shù)值較大即細胞體積較大的細胞群msi-1陽性細胞比例較高，約為67.75％。(3)腸上皮細胞Rho染色特征：與造血干細胞染色特征類似，腸上皮細胞Rho染色可明顯分為三個細胞群，分別是Rho染色陰性、Rho染色弱陽性和Rho染色強陽性細胞，分別約占總細胞的12.3

9、4％、45.26％和41.40％；成功分選出Rho染色陰性和Rho染色強陽性細胞群：前者msi-1和p-g-p1mRNA表達陽性，后者p-g-p1mRNA少量表達；Rho染色陰性細胞大部分處于G0/G1期，約10.37％細胞msi-1蛋白表達陽性。 結(jié)論：Rho染色陰性細胞中含有豐富的腸上皮干細胞，利用腸上皮細胞的Rho染色特點可實現(xiàn)腸上皮干細胞的初步分離、純化。Msi-1作為腸上皮干細胞的特異性的標(biāo)記物，可用來鑒定腸上皮干細胞