膽管癌中Bcl-2表達(dá)意義及Bcl-2 ASODN對(duì)膽管癌細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、膽管癌是起源于膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤,文獻(xiàn)報(bào)道其發(fā)病率有逐年上升趨勢(shì),由于膽管癌特殊的解剖位置和生物學(xué)特性,其治療效果差,雖經(jīng)數(shù)十年努力,膽管癌治療的預(yù)后并無(wú)明顯改善。一隨著膽管癌研究的不斷深入,人們開始從基因水平探索其治療方案,封閉單個(gè)基因表達(dá)的反義概念由Zamecnik和Stephenson首次描述,20多年來(lái),許多研究證明反義寡核苷酸(ASODN)有特異性抑制基因表達(dá)的能力。本研究用免疫組化法證實(shí)了膽管癌組織中Bc1-2蛋白呈高表

2、達(dá),評(píng)價(jià)了Bc1-2表達(dá)在膽管癌發(fā)生及預(yù)后推測(cè)中的作用;進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)肯定了、Bc1-2 ASODN特異性抑制Bc1-2表達(dá)的能力;觀察了Bc1-2 ASODN對(duì)化療藥物足葉乙甙(VP-16)抑制膽管癌細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的影響;探討了Bc1-2 ASODN作用的分子機(jī)制,為膽管癌的反義基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一章 膽管癌組織中Be1-2表達(dá)及其臨床意義 目的:檢測(cè)正常膽管和膽管癌組織中細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bc1-2

3、的表達(dá),分析膽管癌組織中Bc1-2蛋白表達(dá)與膽管癌臨床病理參數(shù)及其術(shù)后生存率的關(guān)系,探討B(tài)c1-2表達(dá)在膽管癌發(fā)生、發(fā)展的作用,評(píng)價(jià)其在膽管癌預(yù)后判斷中的價(jià)值。 方法:免疫組化SP法檢測(cè)36例膽管癌和10例正常膽管石蠟切片標(biāo)本中Bc1-2蛋白的表達(dá),SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析其表達(dá)與膽管癌臨床病理參數(shù)和術(shù)后生存率的關(guān)系,生存率計(jì)算采用Kaplan-Meier法,Log-rank檢驗(yàn)比較生存曲線。 結(jié)果:膽管癌組織中Bc

4、1-2陽(yáng)性表達(dá)率為47.2[％](17/36),正常膽管組織Bc1-2的陽(yáng)性率10.0[％]0(1/10),兩者比較差異有顯著性;低分化的膽管癌Bc1-2陽(yáng)性表達(dá)率75.0[％](6/8)與中分化者46.2[％](6/13)和高分化者33.3[％](5/15)比較,差異有顯著性;Bc1-2陽(yáng)性表達(dá)率在腫瘤大小及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等方面比較差異無(wú)顯著性意義;Bc1-2陰性組術(shù)后1、3、5年存活率分別為82[％],55[％]和25[％],中位生

5、存時(shí)間為24個(gè)月，陽(yáng)性組分別為33％，9％，無(wú)5年生存者，中位生存時(shí)間為9個(gè)月，兩組比較，生存率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：Bcl-2在膽管癌組織中呈高表達(dá)，Bcl-2高表達(dá)在膽管癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能起促進(jìn)作用；Bcl-2表達(dá)狀態(tài)可能是膽管癌的預(yù)后因素之一，陽(yáng)性表達(dá)多提示預(yù)后不良。 第二章Bcl-2 ASODN對(duì)人膽管癌QBC939細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響 目的：檢測(cè)膽管癌細(xì)胞株QBC939中Bcl-2蛋白表達(dá)，觀

6、察Bcl-2ASODN對(duì)膽管癌細(xì)胞株QBC939生長(zhǎng)和凋亡的影響，探討以Bcl-2為靶的膽管癌基因治療的可行性。 方法：①常規(guī)培養(yǎng)膽管癌細(xì)胞株QBC939；②免疫細(xì)胞化學(xué)SP法檢測(cè)膽管癌細(xì)胞株QBC939中Bcl-2表達(dá)；③設(shè)計(jì)、合成特異性靶向Bcl-2 ASODN；④應(yīng)用脂質(zhì)體將Bcl-2ASODN轉(zhuǎn)染人膽管癌QBC939細(xì)胞；⑤采用臺(tái)盼藍(lán)拒染試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活率；⑥采用克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)克隆形成率。 結(jié)果：①Q(mào)BC939

7、細(xì)胞株中Bcl-2蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)； ②臺(tái)盼藍(lán)拒染試驗(yàn)顯示Bcl-2ASODN處理24h，48h及72h后活細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯低于對(duì)應(yīng)的無(wú)義寡聚核苷酸(NSODN)組和對(duì)照組，而NSODN組在24h，48h和72h與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；③克隆形成試驗(yàn)顯示NSODN組和對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)第10天即可見明顯克隆形成，至第14天時(shí)克隆數(shù)目多、克隆大，周圍有較多散在的細(xì)胞。而ASODN組細(xì)胞于培養(yǎng)第13天時(shí)才出現(xiàn)克隆，且克隆小、數(shù)量少，僅少數(shù)散在