紫草素對(duì)鼻咽癌細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)的影響.pdf

1、目的：
　　研究鼻咽癌細(xì)胞株經(jīng)紫草素(shikonin)藥物處理后，檢測(cè)其細(xì)胞增殖抑制率的變化情況，觀察鼻咽癌細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，以及測(cè)算細(xì)胞凋亡率與Bcl-2、Bax基因mRNA表達(dá)量的變化情況，探討紫草素對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖、凋亡以及Bcl-2、Bax基因表達(dá)的影響。
　　方法：
　　1、細(xì)胞培養(yǎng)與藥物處理
　　選擇高分化鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、低分化鼻咽癌細(xì)胞CNE-2和非癌性人永生化鼻咽上皮細(xì)胞NP-69進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)

2、。待細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后在培養(yǎng)液中加入紫草素。本實(shí)驗(yàn)過(guò)程包括對(duì)照組（0μg/ml紫草素）和實(shí)驗(yàn)組（1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml紫草素）。
　　2、應(yīng)用Cell Counting Kit-8（CCK-8）方法檢測(cè)紫草素對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖的影響情況
　　取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，在不同濃度紫草素作用后，采用CCK-8試劑盒檢測(cè)各鼻咽癌細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)處的細(xì)胞增殖抑制率變化情況。
　　3、Hoechst3325

3、8熒光染色觀察紫草素處理后的細(xì)胞核形態(tài)學(xué)改變
　　取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，在熒光顯微鏡下利用Hoechst33258熒光染液觀察紫草素處理后細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象。
　　4、通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)各細(xì)胞株經(jīng)紫草素處理后的細(xì)胞凋亡率變化
　　按照AnnexinⅤ—FITC/PI試劑盒說(shuō)明收集細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析各鼻咽癌細(xì)胞株經(jīng)紫草素處理后的細(xì)胞凋亡率變化情況。
　　5、采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantit

4、ative real time fluorescence polymerase chainreaction，Q-RT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞Bcl-2、Bax mRNA的表達(dá)量
　　提取細(xì)胞總RNA，利用Q-RT-PCR檢測(cè)分析紫草素處理前后的細(xì)胞Bcl-2、BaxmRNA表達(dá)量的變化。
　　6、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　應(yīng)用SPSS17軟件分析各組數(shù)據(jù)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，進(jìn)行分析的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)來(lái)表示，采

5、用t檢驗(yàn)分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、紫草素對(duì)CNE-1、CNE-2和NP-69細(xì)胞增殖抑制的影響
　　以無(wú)藥物處理組細(xì)胞的相對(duì)增殖抑制率為零。1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml紫草素處理CNE-1細(xì)胞24 h抑制率分別為6.4％±0.1％、18.2％±0.2％、33.3％±0.3％，48 h抑制率分別為22.3％±0.2％、58.5％±0.8％、83.3％±1.2％，72h抑制

6、率分別為45.8％±0.7％、84.7％±1.4％、91.7％±2.1％;1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml紫草素處理CNE-2細(xì)胞24 h抑制率分別為9.3％±0.1％、13.5％±0.2％、27.9％±0.4％，48 h抑制率分別為20.3％±0.2％、41.3％±0.5％、76.6％±1.1％，72 h后的抑制率分別為56.7％±0.9％、85.4％±1.5％、93.2％±2.3％。CNE-1、CNE-2的各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖

7、抑制率與對(duì)照組相比，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01），且隨著紫草素濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖抑制率也隨之增加。1μg/ml紫草素作用NP-69細(xì)胞24h、48h、72h后的抑制率分別為0.4％±0.02％、0.5％±0.04％、0.6％±0.05％，5μg/ml紫草素作用NP-69細(xì)胞24h、48h、72h后的抑制率分別為0.3％±0.01％、0.5％±0.03％、0.6％±0.04％，這兩個(gè)濃度實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖抑制

8、率與對(duì)照組相比，差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）;而10μg/ml紫草素作用NP-69細(xì)胞24h、48h、72h后的抑制率分別為2.6％±0.1％、4.9％±0.6％、7.9％±0.8％，此濃度實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖抑制率與對(duì)照組相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且抑制率隨著紫草素作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增高（P＜0.05）。
　　2、利用熒光顯微鏡觀察紫草素處理后的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象
　　經(jīng)Hoechst33258染色的CNE-1、CN

9、E-2對(duì)照組細(xì)胞核染色質(zhì)密度較均勻，紫外光下呈淡藍(lán)色熒光;1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml紫草素處理24h后細(xì)胞數(shù)減少，表現(xiàn)為亮藍(lán)色的核固縮和核碎裂呈分葉狀。NP-69細(xì)胞經(jīng)同樣染色后，未加藥處理組細(xì)胞核染色質(zhì)被染成密度分布均勻的淺藍(lán)色熒光;1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml紫草素處理24h后細(xì)胞基本上未出現(xiàn)明顯的凋亡細(xì)胞特征。
　　3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)紫草素處理前后鼻咽癌細(xì)胞凋亡率的變化
　　以無(wú)藥物處理組

10、為對(duì)照組，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組(5μg/ml)的細(xì)胞凋亡率CNE-1分別為1.9％±0.1％、5.6％±0.7％，CNE-2分別為2.3％±0.2％、15.3％±0.9％，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）。而NP-69的對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組(5μg/ml)細(xì)胞凋亡率分別為0.2％±0.04％、0.3％±0.05％，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　4、紫草素處理前后CNE

11、-1、CNE-2和NP-69細(xì)胞的Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)水平
　　對(duì)照組NP-69細(xì)胞的Bcl-2、Bax mRNA的表達(dá)水平均按100％計(jì)算，對(duì)照組CNE-1、CNE-2細(xì)胞的Bcl-2 mRNA的表達(dá)量分別為131.2％±1.8％、127.5％±1.6％，Bax mRNA的表達(dá)量分別為72.6％±0.9％、79.3％±1.0％;實(shí)驗(yàn)組（5μg/mD NP-69、CNE-1、CNE-2細(xì)胞的Bcl-2 mRNA的表達(dá)量

12、分別為102.6％±1.4％、34.7％±0.3％、22.3％±0.2％，Bax mRNA的表達(dá)量分別為96.9％±1.1％、167.5％±2.4％和189.7％±3.1％。CNE-1、CNE-2經(jīng)紫草素處理后與加藥處理前相比，Bcl-2 mRNA表達(dá)量明顯降低(P＜0.01)，Bax mRNA表達(dá)量則顯著提高(P＜0.01)，而NP-69細(xì)胞Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)量的變化無(wú)明顯差異(P＞0.05)。在對(duì)照組中，兩株鼻咽癌細(xì)胞

13、Bcl-2 mRNA表達(dá)量高于NP-69細(xì)胞(P＜0.05)，Bax mRNA表達(dá)量則低于NP-69細(xì)胞(P＜0.05);而在實(shí)驗(yàn)組中，CNE-1、CNE-2細(xì)胞的Bcl-2 mRNA表達(dá)量低于NP-69細(xì)胞(P＜0.05)，Bax mRNA表達(dá)量則高于NP-69細(xì)胞(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、CCK-8法檢測(cè)顯示，經(jīng)不同濃度紫草素處理后鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-2細(xì)胞增殖能力均存在下降趨勢(shì)，紫草素對(duì)CNE-

14、1、CNE-2的細(xì)胞增殖抑制率隨藥物濃度上升而增加，并呈時(shí)間依賴性趨勢(shì)。
　　2、不同濃度紫草素作用細(xì)胞后，在熒光顯微鏡下觀察鼻咽癌CNE-1、CNE-2細(xì)胞出現(xiàn)典型細(xì)胞核形態(tài)變化:染色質(zhì)濃縮、邊集，核裂碎，呈大小不等、形態(tài)不規(guī)則的碎片狀，并有凋亡小體形成等凋亡細(xì)胞特征。表明紫草素能夠誘導(dǎo)鼻咽癌CNE-1、CNE-2細(xì)胞凋亡。
　　3、AnnexinⅤ-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，紫草素作用CNE-1、CNE-2

15、后細(xì)胞凋亡率增加，且紫草素對(duì)CNE-2細(xì)胞的促凋亡作用強(qiáng)于CNE-1細(xì)胞。表明紫草素對(duì)鼻咽癌CNE-1、CNE-2細(xì)胞具有促凋亡作用，并與腫瘤細(xì)胞分化程度相關(guān)。
　　4、Q-RT-PCR法檢測(cè)顯示，CNE-1、CNE-2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，Bcl-2 mRNA表達(dá)減少，Bax mRNA表達(dá)增加，則Bcl-2/Bax比例降低。提示Bcl-2和Bax參與了紫草素誘導(dǎo)CNE-1、CNE-2細(xì)胞凋亡的過(guò)程，紫草素可能通過(guò)影響B(tài)cl-2