H3N8亞型馬流感病毒樣顆粒的構(gòu)建及馬Tetherin多樣性的研究.pdf

1、馬流感（Equine influenza，EI）是由馬流感病毒（Equine Influenza Virus,EIV）引起的，以感染馬、驢等馬屬動(dòng)物為主的急性、高度接觸性呼吸道傳染病。近年來，馬術(shù)賽事等相關(guān)行業(yè)蓬勃發(fā)展以及養(yǎng)馬業(yè)逐漸興起，EI的公共安全問題在國(guó)際和國(guó)內(nèi)都得到廣泛關(guān)注。
　　Tetherin蛋白被認(rèn)為是對(duì)于包膜逆轉(zhuǎn)錄病毒具有廣泛限制作用的機(jī)體天然免疫蛋白。EIV是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，已經(jīng)證實(shí)Tetherin能限制其出芽

2、。但是Tetherin蛋白在不同物種，甚至同一物種的不同個(gè)體中，都存在著基因水平的多樣性，序列差異從0.5％到4%不等，而序列上的差異可能會(huì)直接影響Tetherin對(duì)病毒的限制作用。本實(shí)驗(yàn)通過采集馬匹血樣，抽提RNA、反轉(zhuǎn)錄DNA，連接到pLB載體送公司測(cè)序，然后從中保留存在突變序列，將突變序列連接到載體pCMV-10上，構(gòu)建了Tetherin突變序列的真核表達(dá)載體。從18匹馬匹中，共獲得了124個(gè)Tetherin序列，其中存在突變序列

3、26個(gè)，突變類型包括替換、缺失以及提前終止，其中，兩個(gè)提前終止突變以及21號(hào)氨基酸位點(diǎn)突變極具參考價(jià)值。這些突變序列真核表達(dá)載體的成功構(gòu)建，對(duì)于實(shí)驗(yàn)室后續(xù)研究Tetherin各個(gè)位點(diǎn)的功能以及Tetherin多樣性與功能的聯(lián)系等方向提供了參考和支持。
　　病毒樣顆粒（Vriurs-likeParticles，VLPs）是近年來研究熱點(diǎn)，在新疫苗開發(fā)、分子載體以及研究某些特定蛋白的作用和病毒感染細(xì)胞機(jī)制等基礎(chǔ)研究方面具有廣泛應(yīng)用。使

4、用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建馬流感VLPs在之前的研究中未有報(bào)道，且哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)可以最高程度的修飾VLPs，使VLPs具有和天然病毒顆粒更相似的天然構(gòu)象，特別是在基礎(chǔ)研究方面，該表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建的VLPs具有更強(qiáng)的模擬性和過程重現(xiàn)性。本實(shí)驗(yàn)選取馬流感H3N8(A/equine/Miami/1/63)的HA、NA、M1、M2這4個(gè)主要結(jié)構(gòu)蛋白，構(gòu)建真核表達(dá)載體，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞收集細(xì)胞上清液中的VLPs。對(duì)上清液測(cè)血凝，血凝效價(jià)為23