流感病毒哺乳動物細胞高產株的獲得及其反向遺傳技術平臺的建立.pdf

1、本研究的目的是：篩選高產的甲型流感病毒母株，獲得其全部8個基因片段的克隆，然后將高產毒株基因與流行毒株的HA和NA片段進行重配，使疫苗株既保持高產的特性，又具有流行毒株抗原性的特點。這樣制備甲型流感疫苗，將是流感疫苗生產的重大變革。本研究的主要內容包括： 1、篩選MDCK細胞高產的甲型流感病毒：通過大量篩選備選病毒(該系列毒株是細胞來源的)，以較低的MOI感染MDCK細胞，獲得哺乳動物細胞高產病毒，并將其高產特性穩(wěn)定下來。

2、 2、細胞高產株全基因組克隆及序列測定：通過流感病毒通用引物反轉錄，特異引物PCR擴增的方法，將該病毒8個基因節(jié)段全部擴增出來，并克隆入中間載體。送測序，每節(jié)段至少3個克隆。獲得了全基因組cDNA序列，共計13588bp。 3、反向遺傳操作雙向雙表達載體的構建：通過PCR反應從質粒PHH21上擴增出一段含人源RNApolymeraseⅠ啟動子和鼠源RNApolymeraseⅠ終止子的序列。將上述PCR產物的酶切片段連入真核細胞

3、表達載體pcDNA3.1(+)中，獲重組質粒。該重組質粒特點是在RNApolymeraseⅡ啟動子和終止序列之間嵌合了RNApolymeraseⅠ啟動子和終止子元件。 4、細胞高產株反向遺傳操作8質粒系統(tǒng)的構建：通過酶切的方式將細胞高產株8個基因節(jié)段分別連入上述載體中，共轉染293T細胞。將轉染上清連續(xù)傳代，空斑純化獲重配病毒。 5、利用6+2重配系統(tǒng)獲得流行株的反向遺傳重配病毒株：將流行株的表面抗原HA，NA基因克隆入