IL-17對(duì)原發(fā)性肝癌生物學(xué)特性的影響及臨床意義研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌在所有惡性腫瘤中發(fā)病率居第五，病死率居第三，其中包括肝細(xì)胞肝癌(hepatocellglar carcinoma，HCC)和肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌(intrahepaticcholangiocarcinoma，ICC)。雖然近年來(lái)肝癌的臨床診治取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，但是由于其高復(fù)發(fā)率和高轉(zhuǎn)移率，肝癌患者的長(zhǎng)期生存仍令人不滿意。當(dāng)前，轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)已成為進(jìn)一步提高肝癌療效的瓶頸和關(guān)鍵。臨床上迫切需要探索和闡明肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的分子機(jī)制、準(zhǔn)確預(yù)測(cè)患者預(yù)后

2、、尋找高效的靶點(diǎn)并設(shè)計(jì)合理干預(yù)治療的新方法。
　　傳統(tǒng)的肝癌研究注重腫瘤細(xì)胞自身，試圖從癌細(xì)胞本身基因與表型改變來(lái)解釋腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。新近的研究越來(lái)越關(guān)注作為與腫瘤密不可分的局部微環(huán)境對(duì)腫瘤演進(jìn)所起的重要作用。炎癥免疫環(huán)境作為腫瘤微環(huán)境的重要組成，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移都有著密切的關(guān)系。由乙型/丙型肝炎病毒感染，或其他非病毒因素如酒精或肥胖等，導(dǎo)致的肝臟慢性炎癥及繼發(fā)的肝硬化狀態(tài)是HCC發(fā)生發(fā)展的“土壤”。而對(duì)于ICC而言，目

3、前眾多研究亦表明其是一種與炎癥密切相關(guān)的惡性腫瘤，炎癥以及相應(yīng)的免疫應(yīng)答在其發(fā)生和進(jìn)展中扮演著重要的角色。
　　TH17細(xì)胞是一類與炎癥及自身免疫性疾病相關(guān)的輔助T細(xì)胞。最近研究發(fā)現(xiàn)TH17細(xì)胞和它的主要功能性因子IL-17在一些腫瘤中明顯升高，但是TH17細(xì)胞與腫瘤免疫之間的關(guān)系尚無(wú)定論。IL-17對(duì)腫瘤的好壞往往取決于腫瘤微環(huán)境狀態(tài)。裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染IL-17后腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)顯著加快；相反，在有免疫力的鼠體內(nèi)，IL-17卻

4、能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)。臨床研究也發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌、卵巢癌中TH17細(xì)胞亦有利于抑腫瘤。另外，最近報(bào)道，環(huán)磷酰胺可通過降低Treg細(xì)胞、升高TH17和TH1細(xì)胞以發(fā)揮抗腫瘤作用。但是，在肝癌中卻發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中升高的TH17/IL17與患者的不良預(yù)后明顯相關(guān)?？梢?，TH17細(xì)胞在腫瘤免疫中發(fā)揮的作用取決于機(jī)體的免疫背景、腫瘤類型及組織器官微環(huán)境等諸多因素。
　　目前，關(guān)于TH17細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子在原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展過程中作用的研究處于

5、起步階段，相關(guān)機(jī)制尚遠(yuǎn)未闡明。本研究通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)性地分析外源性IL-17對(duì)肝細(xì)胞肝癌的生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移的影響及相關(guān)分子機(jī)制。并進(jìn)一步通過組織微列陣技術(shù)，對(duì)HCC和ICC微環(huán)境中以IL-17+細(xì)胞為主的炎癥/免疫活性細(xì)胞的類型、數(shù)目、分布、功能狀態(tài)及相關(guān)臨床意義等進(jìn)行細(xì)致深入的評(píng)估。
　　第一部分IL-17對(duì)人肝細(xì)胞肝癌生長(zhǎng)增殖及侵襲的影響
　　目的：觀察IL-17對(duì)人肝癌細(xì)胞株Huh7、SMMC7721生長(zhǎng)增殖及侵襲的

6、影響。
　　方法：細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)IL-17的受體IL-17R在Huh7、SMMC7721細(xì)胞株的定位及表達(dá)情況。熒光定量PCR檢測(cè)IL-17R在mRNA水平的表達(dá)量。MTT法檢測(cè)IL-17在不同藥物濃度(0，0.1，0.5，1，5，10，50，100 or500 ng/ml)和不同作用時(shí)間(1～4 d)對(duì)Huh7、SMMC7721生長(zhǎng)增殖的影響。細(xì)胞劃痕和transwell實(shí)驗(yàn)觀察IL-17(50 ng/ml)對(duì)Huh7、SMM

7、C7721侵襲遷移能力的影響。
　　結(jié)果：Huh7、SMMC7721肝癌細(xì)胞均存在IL-17R的表達(dá)。不同作用時(shí)間、不同濃度的IL-17對(duì)Huh7、SMMC7721細(xì)胞的相對(duì)增殖率無(wú)明顯影響(p>0.05)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)提示IL-17干預(yù)組的肝癌細(xì)胞較對(duì)照組的遷移能力明顯增強(qiáng)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示IL-17干預(yù)組的肝癌細(xì)胞較對(duì)照組的侵襲能力明顯增強(qiáng)(p<0.05)。
　　結(jié)論：IL-17對(duì)HCC細(xì)胞生長(zhǎng)增殖無(wú)明顯促

8、進(jìn)作用，但可直接通過其受體IL-17RA促進(jìn)腫瘤侵襲和遷移。
　　第二部分IL-17促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌侵襲、演進(jìn)的機(jī)制研究
　　目的：探討IL-17促HCC侵襲、演進(jìn)的相關(guān)機(jī)制。
　　方法：應(yīng)用ELISA法和Western blot方法分別檢測(cè)外源性IL-17作用于Huh7、SMMC7721肝癌細(xì)胞株后相關(guān)炎癥因子和信號(hào)通路的變化情況。并進(jìn)一步采用小干擾RNA(siRNA)技術(shù)干擾STAT3和AKT，以及加入外源性IL-6

9、、IL-6 mAb等，研究IL-17對(duì)相關(guān)陽(yáng)性炎癥因子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。Transwell觀察在不同作用條件下肝癌細(xì)胞侵襲能力的變化。構(gòu)建IL-17穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SMMC7721細(xì)胞，種于裸鼠皮下，觀測(cè)IL-17過表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)侵襲的影響以及相關(guān)炎癥因子、信號(hào)通路的變化情況。免疫組化染色31例人HCC臨床標(biāo)本，分析驗(yàn)證相關(guān)結(jié)果。
　　結(jié)果：IL-17作用于Huh7及SMMC7721細(xì)胞后，IL-6、IL-8、MMP2和VEGF

10、較對(duì)照組明顯升高(p<0.05)，而IL-1β、TNF-αt、TGF-β、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ和IL-12p70變化不明顯(p>0.05)。IL-17明顯上調(diào)p-JAK2、p-STAT3、p-AKT，而對(duì)p-p65 NF-κB、p-JNK、p-ERK1/2、p-p38 MAPK表達(dá)無(wú)明顯影響。AKT干擾可抑制IL-17對(duì)STAT3的活化，但STAT3干擾對(duì)AKT活化卻無(wú)明顯影響。STAT3和AKT干擾均可明顯抑制IL-1

11、7對(duì)IL-8、MMP2、VEGF表達(dá)的上調(diào)(p<0.001)，但I(xiàn)L-6表達(dá)上調(diào)僅在AKT干擾時(shí)被抑制。IL-6 mAb可下調(diào)P-STAT3以及IL-8、MMP2、VEGF的表達(dá)，但對(duì)AKT活化無(wú)明顯影響。外源性加入IL-6可逆轉(zhuǎn)AKT干擾對(duì)IL-8、MMP2、VEGF以及p-STAT3表達(dá)的下調(diào)。裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示IL-17明顯促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、血管形成和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。SMMC7721-17組外周血中的IL-6、IL-8、MMP2、VEG

12、F也明顯較SMMC7721-mock組升高(p<0.01)，SMMC7721-17組腫瘤組織中P-STAT3、P-AKT、MMP2明顯高表達(dá)。通過31例臨床肝癌標(biāo)本顯示，腫瘤內(nèi)IL-17+細(xì)胞密度與微血管密度(r=0.536，P=0.002)和中性粒細(xì)胞密度(r=0.671，P<0.001)均明顯相關(guān)。同時(shí)，p-STAT3表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤內(nèi)IL-17+細(xì)胞密度、微血管密度及中性粒細(xì)胞密度也呈顯著正相關(guān)(分別為：r=0.365，P=0.04

13、3；r=0.478，P=0.007；r=0.519，P=0.003)。
　　結(jié)論：IL-17通過活化AKT來(lái)上調(diào)IL-6的表達(dá)，IL-6進(jìn)一步活化STAT3及STAT3下游的IL-8、MMP2、VEGF，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤侵襲演進(jìn)、血管形成、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　第三部分IL-17聯(lián)合P-STAT3預(yù)測(cè)肝細(xì)胞肝癌預(yù)后的價(jià)值
　　目的：探討IL-17和p-STAT3的表達(dá)與肝癌患者臨床病例特征之間的關(guān)系及預(yù)測(cè)術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的價(jià)值

14、。
　　方法：組織芯片和免疫組化檢測(cè)323例接受根治性切除手術(shù)患者肝癌組織中IL-17與P-STAT3的表達(dá)，根據(jù)兩者表達(dá)水平將患者分別分為兩組、或者聯(lián)合后分為三組，分析兩者與肝癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。
　　結(jié)果：IL-17和P-STAT3均在腫瘤血管侵犯病例中高表達(dá)(p=0.016，P=0.013)，兩者呈顯著正相關(guān)(r=0.315，P<0.001)。生存曲線分析顯示，單獨(dú)IL-17high的術(shù)后總生存率明顯較IL-1

15、7low為低(p=0.001)，術(shù)后復(fù)發(fā)率明顯升高(p=0.016)。單獨(dú)p-STAT3high的術(shù)后總生存率明顯較p-STAT3low為低(p<0.001)，而術(shù)后復(fù)發(fā)率明顯升高(p=0.010)。聯(lián)合組groupⅠ(IL-17high/p-STAT3high組)的術(shù)后總生存率顯著低于groupⅡ(IL-17high/p-STAT3low或IL-17low/p-STAT3high組)和groupⅢ(IL-17low/p-STAT3lo

16、w組)(p=0.001和P<0.001)。GroupⅠ的術(shù)后復(fù)發(fā)率顯著高于groupⅡ和groupⅢ(p=0.047，P=0.001)。單獨(dú)的IL-17、P-STAT3以及兩者的聯(lián)合均是影響術(shù)生存和復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)后因素，但聯(lián)合IL-17與p-STAT3對(duì)生存和復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)價(jià)值高于單個(gè)指標(biāo)。當(dāng)IL-17、p-STAT3以及兩者的聯(lián)合納入同一模型進(jìn)行多因素分析時(shí)，僅兩者的聯(lián)合對(duì)預(yù)測(cè)生存和復(fù)發(fā)有意義(p<0.001和p=0.009)。聯(lián)合組中g(shù)r

17、oupⅠ與groupⅢ相比總生存的風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)為2.244(95％CI，1.529-3.293，p<0.001)，復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)為1.718(95％CI，1.193-2.473，p=0.004)。
　　結(jié)論：IL-17和p-STAT3均是肝癌術(shù)后生存復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)后因素，但I(xiàn)L-17聯(lián)合p-STAT3是一個(gè)更好的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)，更能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)術(shù)后的生存與復(fù)發(fā)。
　　第四部分IL-17與肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌預(yù)后的相關(guān)性研究
　　目的：探

18、討肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌組織中的IL-17陽(yáng)性(IL-17+)細(xì)胞及相關(guān)炎癥、免疫細(xì)胞與預(yù)后的關(guān)系。
　　方法：應(yīng)用組織芯片及免疫組化檢測(cè)123例接受根治性切除手術(shù)患者的肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌組織中IL-17+細(xì)胞、FOXP3陽(yáng)性(FOXP3+)細(xì)胞、CD8陽(yáng)性(CD8+)細(xì)胞、中性粒細(xì)胞(CD66b+)和微血管(CD34+)的分布、密度，并分析其相互間的關(guān)聯(lián)性及與患者預(yù)后之間的關(guān)系。
　　結(jié)果：IL-17+細(xì)胞，F(xiàn)OXP3+細(xì)胞和CD66

19、b+中性粒細(xì)胞主要聚集在癌內(nèi)區(qū)域，顯著高于癌旁(p<0.0001)；而CD8+淋巴細(xì)胞大量聚集在癌-癌旁交界處，顯著高于癌和癌旁組織(p<0.0001)。單因素分析顯示，腫瘤中IL-17+細(xì)胞的密度越高(p=0.00019)或者中性粒細(xì)胞的密度越高(p=0.00024)患者愈后顯著越差，兩者聯(lián)合分析則效果更顯著(p<0.0001)。多因素分析顯示IL-17+細(xì)胞，中性粒細(xì)胞以及兩者聯(lián)合(HR=2.80；95％CI，1.72-4.57；p

20、<0.0001)均為獨(dú)立的預(yù)后因素。ROC曲線分析顯示聯(lián)合癌內(nèi)IL-17+細(xì)胞和中性粒細(xì)胞比常規(guī)的臨床病理特性(如腫瘤大小、肝內(nèi)播散和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等)更能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)預(yù)后(AUC=0.735；95％CI，0.617-0.854；p=0.002)。腫瘤組織中的IL-17+細(xì)胞密度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝內(nèi)播散和進(jìn)展期腫瘤明顯相關(guān)，中性粒細(xì)胞則僅與血管侵襲相關(guān)。此外，瘤內(nèi)IL-17+細(xì)胞與中性粒細(xì)胞密度及微血管密度存在明顯的正相關(guān)(r=0.238，p=0