人重組IL-17蛋白的表達(dá)及其生物學(xué)特性的初步分析.pdf

1、Th1-Th2的經(jīng)典分類的提出已經(jīng)有20年了，它為我們深入理解固有免疫和適應(yīng)性免疫之間的相互聯(lián)系提供了新的思路和研究模型。然而隨著IL-17和IL-12兩個(gè)家族的細(xì)胞因子的發(fā)現(xiàn)和研究，這種分類方法逐漸被予以改變：認(rèn)為機(jī)體內(nèi)存在以分泌IL-17為特征的T細(xì)胞亞群，和以往的Th1，Th2都不同，這群細(xì)胞在IL-23，IL-6和IL-1誘導(dǎo)后產(chǎn)生IL-17細(xì)胞因子，并發(fā)揮獨(dú)特的生物學(xué)效應(yīng)，從而解釋了以前在免疫調(diào)節(jié)，宿主抵抗病菌，免疫病理等方面

2、未能解釋的問題。這種T細(xì)胞現(xiàn)在命名為Th17細(xì)胞。它的特異性在于能分泌IL-17細(xì)胞因子，參與體內(nèi)多種免疫反應(yīng)。Th17細(xì)胞數(shù)量和IL-17在機(jī)體內(nèi)表達(dá)水平的改變，以及Th17細(xì)胞和Th1細(xì)胞比例的變化與疾病的發(fā)展密切相關(guān)并成為廣為關(guān)注的研究課題。為此，本研究旨在表達(dá)重組蛋白和生物學(xué)特性分析作為切入點(diǎn)，為本單位開展相關(guān)工作奠定了一定的物質(zhì)基礎(chǔ)。 一．人IL-17基因全長及去信號肽片段的克隆和載體的構(gòu)建 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的人I

3、L-17的基因序列設(shè)計(jì)合成了全長和去信號肽的特異性引物。采用RT-PCR方法從人外周血PHA刺激活化的T細(xì)胞中擴(kuò)增了人IL-17全長基因和去信號肽基因。應(yīng)用雙酶切法酶切載體和目的基因，再用連接酶連接酶切回收后的產(chǎn)物。測序正確后，在TOP10宿主菌中增殖PQE3.0/IL-17和PCEP4/IL-17質(zhì)粒，經(jīng)酶切和PeR鑒定后PQE3.0/IL-17轉(zhuǎn)化M15表達(dá)菌株。 二．人PQE3.0/IL-17融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)和鑒

4、定 在LB細(xì)菌培養(yǎng)基中增殖M15表達(dá)菌，采取一系列實(shí)驗(yàn)條件，包括降低溫度，縮短誘導(dǎo)時(shí)間等，均證實(shí)不能誘導(dǎo)可溶性IL-17融合蛋白的表達(dá)，而表達(dá)的蛋白主要集中在包涵體內(nèi)。表達(dá)動(dòng)力學(xué)分析表明，應(yīng)用1 mmol/L．IPTG誘導(dǎo)5 h可獲得最有效的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)室規(guī)模增殖表達(dá)菌，經(jīng)超聲裂解和離心，沉淀變性及復(fù)性，透析后經(jīng)HiTrap親和層析柱一步純化融合蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，純化后的IL-17/His融合蛋白純度可達(dá)90％以上，定量為2 m

5、g／ml。應(yīng)用Western-blot對融合蛋白進(jìn)行生物學(xué)鑒定，結(jié)果為約15KD的單一條帶。 三．人IL-17在真核系統(tǒng)中的表達(dá) 抽取PCEP4/IL-17質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，應(yīng)用潮霉素進(jìn)行篩選，在顯微鏡下觀察到陽性克隆，胰蛋白酶消化細(xì)胞，再用移液尖挑取陽性克隆分孔培養(yǎng)，繼續(xù)使用藥物篩選，直到所獲得的克隆表達(dá)穩(wěn)定為止。吸取陽性克隆細(xì)胞培養(yǎng)的上清，用ELISA方法定性和定量檢測IL-17的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是所獲得表達(dá)

6、量較高的融合蛋白。 四．人IL-17重組蛋白的生物學(xué)功能的初步研究 采用人的宮頸癌細(xì)胞株HeLa作為反應(yīng)細(xì)胞，按不同濃度加入IL-17/His融合蛋白和IL-17/Fc融合蛋白，反應(yīng)48小時(shí)后，用EIXSA法檢測上清IL-6和GM-CSF的水平，與對照組作比較，觀察兩種IL-17蛋白對HeLa細(xì)胞的作用在一定劑量范圍內(nèi)是否存在劑量依賴關(guān)系以及兩種蛋白活性度的高低。 綜上所述，本項(xiàng)研究我們成功地應(yīng)用原核和真核系統(tǒng)表