UBE3C在原發(fā)性肝癌中的突變及生物學特性研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌（hepatocellular carcinoma, HCC）在全球常見惡性腫瘤中居第六位，在腫瘤相關性死亡中居第三位。據最新統(tǒng)計，全球每年約有74.8萬新發(fā)肝癌病例，約有75萬人死于肝癌，其中半數發(fā)生在中國。雖然在肝癌早期診斷、手術切除、肝臟移植方面取得了諸多進步，肝癌患者的生存率得到提高，但肝癌患者的總體預后仍然很差。肝癌的發(fā)病機制至今仍不十分清楚，與之相關的易感基因也很缺乏。因此，肝癌相關的新的易感基因的發(fā)現將為肝癌的預

2、防、高危人群的篩查和早期診斷提供生物學標志，并為開發(fā)全新的藥物和基因治療提供靶點。
　　腫瘤的發(fā)生是個復雜的生物學過程，基因變化引起的原癌基因的活化和抑癌基因的失活是其核心。與其他實體腫瘤類似，HCC在其自身發(fā)生、發(fā)展過程中亦累積了大量遺傳變異，這些遺傳變異逐漸累積形成癌前病變并最終演進為腫瘤。現已知道，HCC的形成是一個多因素、多步驟的組織學發(fā)展過程。大部分HCC發(fā)生在由各種原因導致的肝硬化背景上，由慢性乙型或丙型肝炎—異型增生

3、結節(jié)(Dysplastic Nodules，DN)-HCC逐漸演化、發(fā)展而來。因此，通過對比正常細胞基因組、DN基因組和HCC基因組遺傳變異之間的差異，可以發(fā)現與HCC相關的較早期遺傳變異。
　　近年來，新一代測序技術(Next-generation sequencing)的進步，促進了全基因組測序和全基因組外顯子測序的快速發(fā)展，并被廣泛運用于復雜疾病如癌癥易感基因的研究和臨床診斷中。外顯子區(qū)域包含著合成蛋白質所需要的信息，涵蓋了

4、與個體表型相關的大部分功能性變異，同時外顯子區(qū)域是目前基因組中被研究得最為成熟的一部分，使得我們能夠對發(fā)現的變異所在的基因進行注釋和功能途徑分析。由于外顯子僅占整個基因組的1％左右，因此遠比進行全基因組序列測序更經濟、高效。由于其具有對常見和罕見變異高靈敏度，能發(fā)現外顯子區(qū)絕大部分疾病相關變異，促使全外顯子測序成為鑒定孟德爾疾病的致病基因最有效的策略，也被廣泛運用于復雜疾病如癌癥易感基因的研究和臨床診斷中。本研究旨在通過對正常細胞基因組

5、DNA、DN基因組DNA以及HCC基因組DNA進行全外顯子測序分析，尋找與肝癌有關的新的遺傳變異位點，并對篩選出的候選基因進行相應的功能研究。
　　第一部分全外顯子測序尋找肝癌相關遺傳變異位點
　　目的:通過對一例原發(fā)性肝癌病人的外周血淋巴細胞、肝臟異型增生結節(jié)(Dysplastic Nodules，DN)和兩個肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)組織共4個樣本進行外顯子測序分析，尋找與肝癌相

6、關的新的遺傳變異位點。
　　方法:應用Aliglent SureSelect人外顯子序列捕獲(50M)系統(tǒng)和Solexa測序技術，檢測肝臟DN和HCC外顯子區(qū)域的變異位點，通過比對外周血正常淋巴細胞外顯子區(qū)域的變異和NCBI的dbSNP數據庫，過濾掉共有的體細胞SNP變異，從而篩選出肝癌相關的遺傳變異位點，并應用Sanger法測序技術對所篩選出的位點進行驗證。
　　結果:在DN中共發(fā)現5個新的單核苷酸變異(Single Nu

7、cleotide Variations，SNV)，在兩個HCC中分別發(fā)現72個和182個新的SNVs。其中兩個HCC均有SNVs的基因共兩個，分別為位于7號染色體上的UBE3C基因和19號染色體上的MUC16基因，均經過Sanger測序法證實突變。在DN與HCC上均有SNVs的基因沒有發(fā)現。此外，在DN中未發(fā)現新的短插入/缺失(Small indel)變異，在兩個HCC中分別發(fā)現3個和9個新的Small indel變異，分別定位在12個

8、不同的基因上
　　結論:肝臟DN與HCC未發(fā)現共有變異基因，但兩個HCC中均發(fā)現基因UBE3C和MUC16存在變異，提示這兩個基因可能與肝癌發(fā)生密切相關。
　　第二部分候選基因UBE3C的驗證及結構分析
　　目的:探索泛素連接酶E3C(UBE3C)在原發(fā)性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)病例中的突變情況。
　　方法:在另一組105例HCC樣本中，應用常規(guī)Sanger測序技術對U

9、BE3C的全部23個外顯子區(qū)域進行測序，并分析UBE3C基因突變與肝癌臨床病理因素之間的關系。
　　結果:在全部106例（包含全外顯子測序1例）HCC樣本中，共有17例在UBE3C上存在堿基置換的非同義突變，基因突變率16.0％。這些突變位點分別位于UBE3C的5、7、13、20和22號外顯子上，其中Asn929Ile、Glu959Lys和Thr1004Ala三個位點的突變發(fā)生在UBE3C的進化上高度保守的HECT結構域(doma

10、in)上。統(tǒng)計分析結果表明，UBE3C突變與患者性別、年齡、HBV DNA、肝硬化、腫瘤大小、包膜、分化及血管侵犯及腫瘤TNM分期等臨床病理因素均無關。
　　結論:UBE3C在HCC病例中存在多位點、高頻率的突變，Asn929Ile、Glu959Lys和Thr1004Ala的突變可能會對UBE3C的蛋白質功能產生重要影響，參與HCC的發(fā)生、發(fā)展過程。
　　第三部分 UBE3C的腫瘤生物學特性研究
　　目的:研究泛素連接

11、酶E3C(UBE3C)在各種肝癌細胞系和肝癌組織的表達情況，并探索其對人肝癌細胞株Huh7和MHCC97-H生長增殖及侵襲的影響。
　　方法:選用正常肝細胞系L-02和常見的肝癌細胞系SMMC-7721、Huh7、Hep3B、HCCLM3、MHCC97-H和MHCC97-L共7種不同的人肝癌細胞系，通過Western blot方法檢測上述細胞系中UBE3C蛋白表達及分布情況。應用免疫組化方法觀察UBE3C在人肝癌組織及癌旁組織中的

12、表達情況。通過構建穩(wěn)定敲減UBE3C的Huh7和MHCC97-H細胞株，觀察在敲減UBE3C后腫瘤細胞的生長增殖、遷移及侵襲能力的變化。
　　結果:UBE3C在各肝癌細胞系中均有表達，且主要分布在細胞質中，在相對正常的L-02細胞中表達水平較低，而在具有較高侵襲潛能的MHCC97-H細胞和相對較低侵襲潛能的Huh7細胞系中則表達水平較高。在人肝癌組織標本中，UBE3C蛋白主要存在于腫瘤細胞的胞漿中，且在癌組織中的表達水平高于癌旁組