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文檔簡介
1、目的︰以東北紅豆杉(T.cuspidata)的莖培養(yǎng)愈傷組織,研究了6-BA濃度、NAA濃度、2,4-D濃度、采樣季節(jié)和光照條件對東北紅豆杉莖段形成愈傷組織中紫杉醇含量的差異,研究了愈傷組織的生長動態(tài)和紫杉醇積累的動態(tài),以及影響愈傷組織生長和生產(chǎn)紫杉醇的一些因素。
以人肝癌HepG2細(xì)胞系作為體外模型,研究紫杉醇和三尖杉寧堿聯(lián)合應(yīng)用對人肝癌HepG2細(xì)胞株凋亡的誘導(dǎo)作用,并且深入探討其作用機(jī)制,從而為紫杉醇和三尖杉寧堿聯(lián)合應(yīng)用
2、于臨床治療肝癌提供更堅實的實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù),為肝癌的化學(xué)藥物治療探索出一條新的途徑。
方法︰借用最新代謝分析思路,從整體性和動態(tài)性出發(fā),分析在植物生長調(diào)節(jié)劑、光照和溫度作用下的東北紅豆杉愈傷組織體系中紫杉烷代謝譜變化,結(jié)合相關(guān)關(guān)鍵基因的變化,探討紫杉醇生物合成的關(guān)鍵代謝步驟和調(diào)控機(jī)制。調(diào)查歸納東北紅豆杉植株中紫杉烷的生物合成、代謝和積累的規(guī)律。獲得了一年四季植株紫杉烷代謝特征譜。
MTT法檢測不同濃度單藥紫杉醇、單
3、藥三尖杉寧堿及聯(lián)合紫杉醇與三尖杉寧堿不同給藥方案對HepG2細(xì)胞的生長抑制作用;AnnexinV-FITC/PI染色法分析不同聯(lián)合給藥方案對HepG2細(xì)胞凋亡的影響;PI染色法分析不同給藥方案對HepG2細(xì)胞周期分布的影響。
結(jié)果︰植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)在愈傷組織生長和代謝過程中起著重要的作用。高濃度的NAA不利于紫杉醇的合成,而降低NAA的濃度對愈傷組織的生長影響較小。當(dāng)2,4-D與6-BA激素濃度為1:0.05時,紫杉醇含量明顯
4、增高,而生長率僅稍有降低。因此,選用2,4-D濃度為1.0mg·L-1,6-BA濃度為0.05mg·L-1作為細(xì)胞生產(chǎn)紫杉醇的激素組合。在培養(yǎng)周期中,光照對愈傷組織的誘導(dǎo)、生長和紫杉醇的合成有明顯的抑制作用。
不同濃度的紫杉醇與三尖杉寧堿聯(lián)合組對人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用均強(qiáng)于紫杉醇或三尖杉寧堿單用藥組,AnnexinV-FITC/PI染色結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組可檢測到大量的凋亡人肝癌細(xì)胞,明顯多于單用藥組。紫杉醇與三尖杉
5、寧堿聯(lián)合應(yīng)用于人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞可協(xié)同抑制其增殖,并可明顯誘導(dǎo)凋亡發(fā)生。
結(jié)論︰以東北紅豆杉當(dāng)年生嫩莖作為外植體,以B5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,通過正交設(shè)計篩選出的誘導(dǎo)培養(yǎng)基的激素方案為NAA濃度1.0mg·L-1,6-BA濃度0.05mg·L-1,2,4-D濃度1.0mg·L-1。
本研究用MTT法證實兩藥聯(lián)合有協(xié)同作用,AnnexinV-FITC/PI雙染法亦證實聯(lián)合給藥明顯較單藥組凋亡細(xì)胞數(shù)目多。同時本研究發(fā)
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