尾加壓素II刺激大鼠主動脈外膜成纖維細(xì)胞表達(dá)骨橋蛋白的作用及機制研究.pdf

1、背景:尾加壓素II（urotensin II，UII）是繼內(nèi)皮素之后新發(fā)現(xiàn)的強力縮血管活性肽，能夠促進血管平滑肌細(xì)胞、外膜成纖維細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞增殖，促進心肌細(xì)胞肥大，促進成纖維細(xì)胞合成膠原，促進泡沫細(xì)胞形成，從而在多種心血管疾病發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。近年我室研究發(fā)現(xiàn)UII尚能誘導(dǎo)血管外膜成纖維細(xì)胞遷移，并且骨橋蛋白（Osteopontin,OPN）參與了該過程。由于骨橋蛋白是參與血管重塑和心肌重塑的重要活性因子，因此，闡明

2、UII和骨橋蛋白表達(dá)之間的關(guān)系具有重要的意義。
　　 目的:研究UII對大鼠主動脈外膜成纖維細(xì)胞表達(dá)OPN的影響及可能參與的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　 方法:取雄性SD大鼠，分離主動脈外膜，剪碎為1mm3大小，采用組織貼塊法培養(yǎng)外膜成纖維細(xì)胞，實驗用3-5代細(xì)胞，經(jīng)無血清DMEM同步化培養(yǎng)24h后進行隨機分組實驗：（1）對照組：細(xì)胞置于無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；（2）UII刺激組：按照實驗設(shè)計，分為不同濃度UII刺激組(

3、10- 10、10-9、10-8、10-7mol/L)和不同時間刺激組，后者將細(xì)胞和UII（10-8mol/L）共孵育不同時間（1h，3h，6h，12h，24h)；（3）UII+細(xì)胞內(nèi)不同信號通路抑制劑組：培養(yǎng)液中預(yù)先加入不同信號阻斷劑，如UII受體阻斷劑SB710411(10-6mol/L)、鈣通道阻斷劑nicardipine(10-5mol/L)、PKC抑制劑H7（10-5 mol/L)、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑環(huán)孢霉素A(10-5mo

4、l/L)、Rho 激酶抑制劑Y-27632（10-5mol/L)或絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase, MAPK）抑制劑PD98059（10-5mol/L)刺激30min后，再加入UII（10-8mol/L）共孵育6h或12h，分別收集細(xì)胞和培養(yǎng)基，用半定量RT-PCR測定細(xì)胞OPN mRNA表達(dá)量；收集培養(yǎng)液，采用ELISA方法檢測骨橋蛋白分泌量。
　　 結(jié)果:UII明顯誘導(dǎo)大鼠

5、主動脈外膜成纖維細(xì)胞表達(dá)OPN。不同濃度UII刺激細(xì)胞后，隨UII濃度增加，細(xì)胞OPN表達(dá)量逐漸增加，至10-8 mol/l UII達(dá)到高峰。10- 10、10-9、10-8和10-7mol/L UII刺激組OPN mRNA表達(dá)分別較對照組增加20.1%（P>0.05）、59.8%（P<0.05）、88.7%（P<0.01）和68.3%（P<0.05），而OPN 蛋白表達(dá)量較對照組分別提高了25.6%（P>0.05）、49.8%（P<0

6、.05）、74.9%（P<0.01）和24.6%（P>0.05）。UII（10-8 mol/L）刺激細(xì)胞后1h、3h、6h和12h OPN mRNA表達(dá)分別較對照組提高111.2%（P<0.01）、253.2%（P<0.01）、119.1%（P<0.01）和4.9%（P>0.05）；10-8 mol/L UII刺激成纖維細(xì)胞6h、12h和24h后OPN蛋白分泌量較對照組分別增加59.4%（P<0.05）、74.9%（P<0.05）和42

7、.7%（P>0.05）。UII的該作用能夠被SB710411、nicardipine、H7、環(huán)孢霉素A、Y-27632和PD98059所抑制，OPN mRNA抑制率分別為25.2%、23.7%、20.4%、43.1%、15.6%、29.0%（均為P<0.01），其相應(yīng)OPN蛋白抑制率分別為29.3%（P<0.05）、52.7%（P<0.01）、24.7%（P<0.05）、46. 7%（P<0.01）、38.7%（P<0.01）和39.7