干擾素誘導(dǎo)蛋白16對(duì)人主動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞增殖、遷移及凋亡的影響.pdf

1、目的：本文將觀察干擾素誘導(dǎo)蛋白16沉默和過表達(dá)對(duì)人主動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞（HAAFs）增殖、遷移及凋亡的影響，并探討其機(jī)制。
　　方法：1、沉默IFI16時(shí)，實(shí)驗(yàn)分為3組：在HAAFs中轉(zhuǎn)染針對(duì)IFIl6基因的小分子干擾RNA(siRNA)作為IFI16基因沉默組（si-IFI16），轉(zhuǎn)染非特異性siRNA作為陰性對(duì)照組（NC），以及未經(jīng)處理的HAAFs組（Con）。2、IFI16過表達(dá)時(shí)，實(shí)驗(yàn)分為3組：未經(jīng)處理的HAAFs組（Co

2、ntrol)、感染綠色熒光標(biāo)記的control慢病毒組（Lv-GFP）、感染綠色熒光標(biāo)記的 IFI16基因慢病毒組（Lv-IFI16-GFP）。3、通過轉(zhuǎn)染control siRNA（FITC conjugate）-A觀察HAAFs的轉(zhuǎn)染效率，通過感染攜帶熒光標(biāo)記的慢病毒觀察HAAFs的感染效率。4、應(yīng)用總RNA極速抽提試劑盒提取總RNA，RT-PCR試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，Real-Time PCR熒光染料試劑檢測細(xì)胞中IFI16 m

3、RNA的變化。5、收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，按約3000個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板，通過CCK8試劑盒檢測HAAFs細(xì)胞活力情況，將CCK-8溶液加入到培養(yǎng)基中，在37℃含有5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，在酶標(biāo)儀上測A450 nm處吸光值。6、應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡和周期，收獲細(xì)胞，用PBS沖洗，重懸，按照PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I試劑盒檢測細(xì)胞凋亡，按照細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡試劑盒檢測細(xì)胞

4、周期。7、通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移情況。8、通過Western blot檢測細(xì)胞中IFI16、ERK1/2、p-ERK1/2、p53、p21、Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)。首先應(yīng)用12%膠的分離蛋白并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，在含5%脫脂奶粉的TBST溶液中封閉1h，加入一抗工作液，4℃過夜，然后是室溫下孵育二抗工作液1 h，應(yīng)用ECL發(fā)光。
　　結(jié)果：1、與Con組和NC組比較，si-IFI16組的IFI

5、16 mRNA和蛋白水平明顯下調(diào)，p53、p21、Bax及Bax/Bcl-2的蛋白表達(dá)減少，同時(shí)Bcl-2的蛋白表達(dá)和ERK1/2的磷酸化水平增高。通過抑制細(xì)胞內(nèi)源性IFI16的表達(dá)，HAAFs細(xì)胞活力增強(qiáng)，增加了細(xì)胞周期G1/S的轉(zhuǎn)換，細(xì)胞的遷移距離和數(shù)量增加，細(xì)胞凋亡減少。2、與Control組和Lv-GFP組比較，Lv-IFI16-GFP組的IFI16 mRNA的上調(diào)以及IFI16、p53和p21蛋白表達(dá)增加，HAAFs細(xì)胞活力減