AT1受體抑制劑對雌激素作用下的子宮內(nèi)膜癌細胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、無孕激素拮抗的高水平雌激素長期刺激與子宮內(nèi)膜癌發(fā)病關(guān)系密切,對于雌激素誘發(fā)子宮內(nèi)膜癌的機制研究更多圍繞其受體依賴作用,而對雌激素非受體依賴作用研究較少?，F(xiàn)有研究證實血管緊張素Ⅱ受體1(AT1-R)可以激活雌激素受體(-)的SKBR3乳腺癌細胞系中MAPK的活性,促進乳腺癌細胞增殖,所以我們推測雌激素是否能夠通過AR1-R促進雌激素受體(ER)低表達的子宮內(nèi)膜細胞增殖。本研究從子宮內(nèi)膜癌發(fā)病中雌激素的非受體依賴機制這一新方向著手,探討雌激

2、素是否能夠通過AT1-R而不依賴于ER誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡抑制,從全新角度研究雌激素在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生過程中的分子機制,同時找到拮抗這種分子機制的方法,渴望能通過控制雌激素非受體依賴性作用,最終抑制細胞周期的進展,為ER低表達的子宮內(nèi)膜癌的治療提供新的理論依據(jù)和治療靶點。
　　 目的：
　　 本實驗采用免疫細胞化學(xué)方法,MTT法、流式細胞技術(shù)及免疫印跡研究子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細胞中AT1-R、PI3K、p-Akt、ER

3、K蛋白的表達及其相關(guān)性,探討雌激素(E2)及AT1-R抑制劑saralasin對HEC-1A細胞的增殖、細胞周期和凋亡的影響。
　　 材料與方法：
　　 1、主要材料與儀器
　　 HEC-1A細胞株；胎牛血清；McCoy’s 5a培養(yǎng)基；水溶性17β-雌激素；AT1-R抑制劑saralasin和雌激素受體抑制劑ICI182780;兔抗人AT1-R抗體、PI3K抗體、p-Akt抗體及ERK抗體;山羊抗兔FITC熒光

4、標記二抗；碘化丙啶(PI)；AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑盒；辣根過氧化酶標記的山羊抗兔IgG；超凈工作臺；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱;倒置相差顯微鏡；激光共聚焦顯微鏡觀察；分光光度計；流式細胞儀;超速低溫離心機；電泳儀；轉(zhuǎn)印槽；自動凝膠成像分析儀
　　 2、實驗方法
　　 將HEC-1A細胞置于含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的McCoy’s 5a培養(yǎng)液中,于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),

5、使其貼壁生長。細胞長滿95％以上后用0.25％胰酶進行消化傳代。
　　 應(yīng)用免疫細胞化學(xué)方法檢測AT1-R、PI3K、p-Akt、ERK蛋白在HEC-1A細胞中的表達；應(yīng)用MTT法、流式細胞技術(shù)檢測雌激素作用于HEC-1A細胞不同時間后細胞增殖、細胞周期和凋亡的變化,以及saralasin對雌激素誘導(dǎo)下的HEC-1A細胞增殖、細胞周期和凋亡的影響；Western blot分析雌激素作用后HEC-1A細胞中的ERK、p-Akt蛋白

6、表達的變化,及saralasin對雌激素誘導(dǎo)下的HEC-1A細胞中ERK、p-Akt蛋白表達的影響。
　　 3、統(tǒng)計學(xué)分析
　　 采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理,應(yīng)用方差分析,LSD-t檢驗進行組間比較,數(shù)據(jù)以(x)±s表示,取P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、AT1-R、PI3K、p-Akt及ERK蛋白在HEC-1A細胞中的表達
　　 激光共聚焦顯微鏡觀察AT1

7、-R、PI3K、ERK、p-Akt蛋白在HEC-1A細胞中的表達情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)AT1-R、PI3K、ERK蛋白主要在細胞質(zhì)中表達,p-Akt蛋白主要在細胞核中表達。
　　 2、雌激素及saralasin對HEC-1A細胞增殖的影響
　　 MTT結(jié)果提示在藥物作用5min、10min、15min時E2對HEC-1A細胞具有促增殖作用；在藥物作用10min時,saralasin對HEC-1A細胞有明顯的抑制作用；在藥物作用各

8、時間段內(nèi),ICI182780對HEC-1A細胞均無明顯的抑制作用。
　　 3、雌激素及saralasin對HEC-1A細胞周期和凋亡的影響
　　 流式細胞技術(shù)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)雌激素作用10min后HEC-1A細胞的G0～G1期細胞比例下降,S期的比例升高；saralasin作用于雌激素誘導(dǎo)的HEC-1A細胞10min后,其G0～G1期細胞的比例升高,S期細胞的比例相對下降,同時促使HEC-1A細胞發(fā)生凋亡,以晚期凋亡為主；而

9、ICI182780作用于雌激素誘導(dǎo)的HEC-1A細胞10min后,對HEC-1A細胞的細胞周期及促凋亡作用不明顯。
　　 4、雌激素及sarallasin對HEC-1A細胞中ERK、p-Akt蛋白表達的影響
　　 Western blot結(jié)果提示雌激素處理10min后,HEC-1A細胞中ERK1/2蛋白的表達明顯上調(diào)；Saralasin作用10min后可使雌激素誘導(dǎo)的HEC-1A細胞中ERK1/2蛋白的表達明顯下調(diào)；而I

10、CI182780作用HEC-1A細胞10min后ERK1/2蛋白的表達下調(diào)不明顯。各處理因素作用后HEC-1A細胞中p-Akt蛋白的表達無明顯差異。
　　 結(jié)論：
　　 1、雌激素對HEC-1A細胞具有促增殖作用,而雌激素受體抑制劑ICI182780對雌激素誘導(dǎo)的HEC-1A細胞增殖、細胞周期以及細胞凋亡沒有明顯作用,提示雌激素對HEC-1A細胞的促增殖作用是ER非依賴性的。
　　 2、AT1-R在HEC-1A細

11、胞中高表達,抑制AT1-R后,HEC-1A細胞增值率明顯下降,凋亡率增加,細胞周期停滯在G0～G1期,ERK1/2蛋白的表達明顯下調(diào),所以我們推測雌激素可能通過AT1-R促進HEC-1A細胞增殖,其作用機制可能是通過激活MAPK信號傳導(dǎo)途徑來實現(xiàn)的。
　　 3、ICI182780對ER低表達的子宮內(nèi)膜癌細胞HEC-1A無明顯的抑制作用,而AT1-R抑制劑Saralasin對HEC-1A細胞增殖有明顯的抑制作用,對于雌激素受體低表