DNMT抑制劑和HDACIs對子宮內(nèi)膜癌抑制作用的研究.pdf

1、目的：本文首先研究了臨床標本中E-cad的表達和啟動子甲基化狀態(tài)在子宮內(nèi)膜癌中的意義，觀察DNMT抑制劑DAC和HDACIs中SAHA、VPA對子宮內(nèi)膜癌細胞系HEC-1B和RL-952體內(nèi)和體外的抑制作用，探討在體內(nèi)和體外藥物作用下細胞增殖、周期、凋亡、甲基化狀態(tài)和E-cad的表達變化。方法：第一部分應(yīng)用免疫組化SP、RT-PCR和MSP檢測臨床標本中E-cad在子宮內(nèi)膜癌中蛋白和mRNA表達以及E-cad啟動子甲基化狀態(tài)與臨床關(guān)系。

2、第二部分為體外實驗檢測DAC與SAHA、VPA對HEC-1B和RL-952細胞系生物學的影響，主要方法為RT-PCR、MSP、TUNEL、MTT、Western-blot和FCM，觀察藥物作用前后細胞增殖、周期、凋亡、E-cad甲基化狀態(tài)和表達的影響。第三部分為DNMT抑制劑和HDACIs作用的體內(nèi)部分，觀察DAC和VPA對HEC-1-B細胞裸鼠移植瘤的生長抑制作用和對移植瘤凋亡的形態(tài)、AI以及E-cad表達的影響，主要方法為免疫組化、

3、MSP、HE染色、TEM、TUNEL和RT-PCR。 結(jié)果：1、E-cad和β-cat定位于細胞膜，從NE到CE的進展過程中，E-cad表達陽性率下降(P＜0.05)。CE中臨床Ⅰ+Ⅱ期表達陽性率高于Ⅲ+Ⅳ期(P＜0.05)；無肌層浸潤和浸潤深度≤1/2表達高于浸潤深度＞1/2的標本(P＜0.05)；病理分級G1、G2、G3組間差異顯著(P＜0.05)。隨著臨床期別升高、腫瘤組織的去分化、肌層浸潤深度增加和淋巴的轉(zhuǎn)移，β-cat

4、表達降低(P＜0.05)。 2、E-cad、β-cat陽性患者5年生存率高于陰性表達組(P＜0.05)。E-cad和β-cat均陽性組5年生存率高于E-cad或β-cat單一陽性組、E-cad和β-cat均陰性組(P＜0.05)。E-cad非甲基化患者5年生存率高于甲基化患者(P＜0.05)。 3、在NE和AHE中無E-cad啟動子甲基化，而CE中甲基化發(fā)生率為36.59％。隨著腫瘤細胞的去分化，臨床分期增高，肌層浸潤深

5、度增加和淋巴的轉(zhuǎn)移E-cad啟動子甲基化率逐漸增加(P＜0.05)。E-cad啟動子區(qū)5'CpG島甲基化會使E-cad核酸與蛋白表達下降或缺失。 4、HEC-1-B和RL-952細胞系E-cad啟動子均發(fā)生甲基化。應(yīng)用DAC后去甲基化，而VPA和SAHA不能產(chǎn)生去甲基化作用。 5、DAC、SAHA和VPA對子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B和RL-952細胞增殖的抑制作用呈劑量和時間依賴性；可以增加HEC-1-B和RL-952細胞

6、G0/G1期比例，將細胞周期阻滯在DNA合成前期，同時使AI增高。同一藥物相同濃度下HEC-1-B細胞對增殖、周期抑制和誘導凋亡的敏感性比RL-952強。6、DAC、VPA和SAHA體外能夠上調(diào)E-cadmRNA和蛋白表達，下調(diào)bcl-2mRNA表達。 7、裸鼠接種HEC-1-B細胞成瘤率為85.71％，DAC和VPA單獨或聯(lián)合應(yīng)用并無明顯的體內(nèi)毒性作用。經(jīng)過對荷瘤裸鼠6周的治療，各治療組裸鼠移植瘤體積明顯小于對照組，生長抑制率

7、明顯高于對照組(p＜0.05)。DAC組與其他各治療組間差異顯著(p＜0.05)；VPA單藥治療組與VPA聯(lián)合治療組差異顯著(p＜0.05)；VPA單藥治療組間、VPA5聯(lián)合組間比較無差異(p＞0.05)。 8、DAC和VPA作用下荷瘤裸鼠腫瘤細胞死亡形式是以細胞凋亡為主。對照組AI明顯低于各治療組(p＜0.01)。DAC組與VPA單藥治療組比較無顯著差異(p＞0.05)，與VPA聯(lián)合治療組比較差異顯著(p＜0.05)；VPA5

8、mg治療組與聯(lián)合治療組比較差異顯著(p＜0.05)；VPA10mg組與聯(lián)合治療組比較無顯著差異(p＞0.05)；VPA單藥治療組間、聯(lián)合治療組間比較無顯著差異(p＞0.05)。 9、DAC和VPA體內(nèi)可以增加E-cadmRNA和蛋白表達，下調(diào)bcl-2mRNA表達(p＜0.05)。 結(jié)論：1、E-cad表達下降和啟動子區(qū)5'CpG島甲基化是子宮內(nèi)膜癌區(qū)別于正常組織的較早期分子事件，與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生有關(guān)，二者異常可早期判斷

9、子宮內(nèi)膜癌的侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后。啟動子區(qū)5'CpG島甲基化是調(diào)節(jié)E-cad表達的重要機制。 2、VPA、SAHA和DAC可通過G0/G1期阻滯、增加AI和解除轉(zhuǎn)錄抑制上調(diào)E-cad表達和下調(diào)bcl-2發(fā)揮對RL-952和HEC-1-B細胞系的抑制作用。 3、子宮內(nèi)膜癌細胞HEC-1-B裸鼠皮下移植瘤的成瘤率為85.71％，DAC和VPA對移植瘤生長有很強的抑制作用，二者聯(lián)合應(yīng)用效果更加明顯，而且無明顯毒副作用。DAC和VP

10、A體內(nèi)可誘導腫瘤細胞凋亡，上調(diào)E-cad和下調(diào)bcl-2mRNA表達。 本課題創(chuàng)新點：1、國內(nèi)首次建立子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B細胞系裸鼠皮下移植瘤模型。 2、將DNMT抑制劑和HDACIs聯(lián)合應(yīng)用治療荷瘤裸鼠，并且取得良好效果，目前國際上未見報道。 3、發(fā)現(xiàn)DNMT抑制劑和HDACIs可通過bcl-2途徑誘導細胞凋亡，目前國際上未見報道。 4、分析E-cad啟動子甲基化狀態(tài)與子宮內(nèi)膜癌患者五年生存狀況，國