MAPK通路抑制劑對PTEN缺失人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的:子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道常見的惡性腫瘤之一，約占女性癌癥總數(shù)的7％，嚴(yán)重威脅女性健康，其發(fā)生的分子機(jī)制尚不清楚。它的發(fā)生是一漫長過程，早期發(fā)現(xiàn)是有效治療的關(guān)鍵。近年研究表明，在其發(fā)生發(fā)展過程中抑癌基因的失活、突變和信號通路的異常激活可能發(fā)揮了重要作用。
　　 MAPK家族信號通路是引起細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)的重要信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，是細(xì)胞外與細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的交匯點(diǎn)，其在腫瘤的形成、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中都扮演著重要角色，該通路成員已經(jīng)成為腫

2、瘤新藥研制的分子靶點(diǎn)之一。目前研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展與一些信號通路的活性改變密切相關(guān)，其中主要包括MAPK和EGFR兩條信號通路。
　　 PTEN作為一個(gè)抑癌基因，在細(xì)胞生長、凋亡中具有重要生物學(xué)功能。迄今為止，已有大量研究證實(shí)PTEN基因?qū)φ隙鄺l上下游信號通路有重要作用。許多前期研究也發(fā)現(xiàn)，相關(guān)信號通路僅在PTEN缺失情況下對相關(guān)信號通路抑制劑敏感。而PTEN基因在人子宮內(nèi)膜癌中的丟失率可高達(dá)60％～80％。因此，本實(shí)

3、驗(yàn)中我們使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染方法改變兩株子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中PTEN表達(dá)，旨在探討相關(guān)信號通路抑制劑誘導(dǎo)不同PTEN表達(dá)下人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的凋亡和增殖抑制等情況，為選擇以相關(guān)信號通路為靶點(diǎn)的子宮內(nèi)膜癌治療，提高臨床療效提供一定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.激光共聚焦顯微鏡檢測Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá)；免疫組化法和western blot法分別檢測磷酸化p38MAPK蛋白表達(dá)，p38MAPK信號通路下

4、游磷酸化靶蛋白ATF-2表達(dá)。探討PTEN缺失Ishikawa和PTEN完整HEC-1 A細(xì)胞中p38MAPK信號通路的活性。
　　 2.PTEN小分子干擾RNA及PTEN基因轉(zhuǎn)染后，激光共聚焦顯微鏡檢測PTEN蛋白表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)、MTT法、實(shí)時(shí)定量PCR及western blot分別檢測細(xì)胞干預(yù)后子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞早期凋亡及細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖活性、p38MAPK下游底物ATF-2 mRNA表達(dá)、p38MAPK通路的磷酸化水平及其

5、下游底物4E-BP1蛋白的磷酸化水平、磷酸化eIF4E蛋白、凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3及Bax表達(dá)。比較PTEN缺失和表達(dá)情況下人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa及HEC-1A對SB203580的作用及可能作用機(jī)制。
　　 3.將人子宮內(nèi)膜癌(Ishikawa，HEC-1A細(xì)胞)細(xì)胞移植于裸鼠皮下，成功建立子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型；SB203580多點(diǎn)注射Ishikawa及HEC-1A裸鼠皮下移植瘤瘤體

6、，DMSO和PBS注射組作為對照。Western blot檢測瘤體PTEN、磷酸化p38MAPK蛋白表達(dá)、比較注射對裸鼠皮下移植瘤生長的影響、免疫組化法分析瘤體中PCNA(增殖細(xì)胞核抗原)及Ki67(細(xì)胞增殖抗原)蛋白表達(dá)、HE染色觀察裸鼠肝臟和腎臟的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)。探討PTEN缺失或表達(dá)下子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中p38MAPK信號通路抑制劑的體內(nèi)作用。
　　 結(jié)果:
　　 1.Ishikawa細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá)缺失，HEC-1

7、A細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)(P＜0.01)；兩株細(xì)胞中均存在磷酸化p38MAPK蛋白表達(dá)，而Ishikawa細(xì)胞中表達(dá)水平要高于HEC-1A細(xì)胞(P＜0.05)；Ishikawa細(xì)胞中ATF-2蛋白磷酸化亦明顯高于HEC-1A細(xì)胞(＜0.05)。
　　 2.小分子干擾RNA封閉與PTEN穩(wěn)定轉(zhuǎn)染使兩株子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞(IshikawaPTEN null，HEC-1A PTEN intact)PTEN表達(dá)改變。SB203580干預(yù)可使P

8、TEN缺失Ishikawa及HEC-1A細(xì)胞生長顯著抑制、細(xì)胞發(fā)生早期凋亡并引致細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯；細(xì)胞內(nèi)ATF-2 mRNA表達(dá)下調(diào)、p38MAPK通路磷酸化水平均降低、磷酸化eIF4E及4E-BP1蛋白表達(dá)均顯著下降，同時(shí)cleaved caspase-3及Bax表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.05)；而對PTEN表達(dá)HEC-1A及Ishikawa細(xì)胞則無明顯上述改變，與PTEN缺失兩種細(xì)胞比較這些差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。

9、>　　 3.Western Blot顯示Ishikawa細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤中PTEN蛋白表達(dá)缺失，SB203580注射組磷酸化p38MAPK蛋白的表達(dá)顯著下降；SB203580注射治療對人子宮內(nèi)膜癌PTEN缺失Ishikawa細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤生長均有明顯抑制作用，抑瘤率可達(dá)59.1％；免疫組化示Ishikawa細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤瘤組織細(xì)胞漿中PCNA及Ki67染色強(qiáng)度減弱，表達(dá)顯著下調(diào)，與PBS注射組和DMSO注射組相比，差異有顯著

10、性(P＜0.05)；注射后裸小鼠肝臟和腎臟組織結(jié)構(gòu)正常。而對PTEN表達(dá)HEC-1A細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤則無明顯上述改變，與Ishikawa細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤比較這些差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1.二種子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中均存在p38MAPK信號通路激活，這種激活水平與PTEN表達(dá)相關(guān)，PTEN缺失Ishikawa細(xì)胞的激活水平較高。
　　 2.人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中內(nèi)外源性的PTEN缺失使

11、兩株細(xì)胞中p38MAPK通路活化，對p38MAPK相關(guān)抑制劑的敏感性增加。其機(jī)制可能與PTEN缺失導(dǎo)致PTEN對p38MAPK信號通路負(fù)性調(diào)控功能的喪失，使p38MAPK信號通路的下游底物4E-BP1激活，然后通過eIF4E靶基因的轉(zhuǎn)錄改變引致p38MAPK通路活化，最終使導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展。抑制p38MAPK信號通路有望成為治療子宮內(nèi)膜癌的一個(gè)新靶點(diǎn)，其可能機(jī)制為PTEN缺失情況下，p38MAPK信號通路特異性抑制劑SB20358