siRNA干擾CDKs對細胞周期和細胞凋亡的影響.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：CDK1siRNA干擾對細胞周期和凋亡的影響
　　 目的：研究CDK1 siRNA干擾抑制CDK1的表達及其對細胞周期和凋亡的影響。
　　 材料和方法：以人宮頸癌細胞株Hela細胞和人結(jié)腸癌細胞株SW480細胞為研究對象，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CDK1 siRNA，分別用realtime-PCR、westernblot檢測CDK1基因和蛋白的表達，AnnexinV/PI法檢測轉(zhuǎn)染細胞的凋亡

2、，流式細胞術(shù)分析細胞周期分布，細胞進行瑞氏-姬姆薩染色后鏡下觀察其形態(tài)學變化。
　　 結(jié)果：轉(zhuǎn)染CDK1 siRNA后CDK1基因和蛋白的表達都下降。轉(zhuǎn)染后24 小時，CDK1 蛋白表達已經(jīng)下降，到轉(zhuǎn)染后48小時、60 小時，CDK1基因與蛋白都明顯降低。轉(zhuǎn)染CDK1 siRNA 48和60 小時后的細胞周期G2/M 期比例明顯增加，而細胞凋亡率與對照相比沒有明顯升高。轉(zhuǎn)染細胞經(jīng)瑞氏-姬姆薩染色后，顯微鏡下看到雙核細胞增多。

3、r>　　 結(jié)論：CDK1 siRNA干擾導致的CDK1表達降低只引起細胞周期G2/M 期阻滯，細胞增殖減慢，沒有導致細胞凋亡。
　　 第二部分：CDK1siRNA干擾在Taxol誘導細胞凋亡中的作用
　　 目的：研究轉(zhuǎn)染CDK1 siRNA 在Taxol誘導細胞凋亡過程中的對細胞周期和凋亡的影響，探討CDK1 在細胞凋亡中的確切作用。
　　 方法：以人宮頸癌細胞株Hela細胞和人結(jié)腸癌細胞株SW480細胞為研究

4、對象，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CDK1 siRNA，轉(zhuǎn)染后48 小時加Taxol(20g/ml)刺激，實驗設(shè)空白對照（未處理）、陰性對照（轉(zhuǎn)染陰性 siRNA）、空白對照加Taxol、陰性對照加Taxol、轉(zhuǎn)染CDK1 siRNA、轉(zhuǎn)染CDK1 siRNA 加Taxol 實驗組。加藥12 小時后收集細胞，用AnnexinV/PI方法檢測細胞的凋亡；流式細胞儀檢測細胞DNA含量，分析細胞周期的變化；westernblot檢測CDK1、BCL2 蛋白的表

5、達。
　　 結(jié)果：CDK1 蛋白表達水平在轉(zhuǎn)染siRNA組都有明顯降低。Taxol(20ug/ml)刺激12 小時細胞出現(xiàn)明顯G2/M 期和S 期阻滯以及細胞凋亡。細胞轉(zhuǎn)染CDK1 siRNA后再用Taxol刺激，G2/M、S 期阻滯效應(yīng)和細胞的凋亡反應(yīng)都沒有明顯改變?？沟蛲龅鞍譈CL2 也只在加Taxol 刺激組表達下降。
　　 結(jié)論：siRNA干擾導致的CDK1表達降低對紫杉醇Taxol所誘導的細胞周期阻滯和細胞凋亡

6、作用沒有影響。
　　 第三部分：共轉(zhuǎn)染CDK1、CDK2siRNA對細胞周期和細胞凋亡的影響
　　 目的：研究共轉(zhuǎn)染CDK1、CDK2 siRNA 同時抑制CDK1、CDK2 蛋白表達對細胞周期和凋亡的影響，探討細胞周期主要調(diào)控分子在細胞凋亡中的確切作用。
　　 方法：以人宮頸癌細胞株Hela細胞和人結(jié)腸癌細胞株SW480細胞為研究對象，用脂質(zhì)體lipofactamine2000 同時轉(zhuǎn)染CDK1和CDK2 si

7、RNA。在轉(zhuǎn)染后48、60 小時收集細胞，用westernblot檢測CDK1、CDK2 蛋白的表達和抗凋亡蛋白Bcl2的表達，AnnexinV/PI檢測轉(zhuǎn)染細胞的凋亡，流式細胞術(shù)DNA含量檢測分析細胞周期阻滯。AnnexinV/PI標記的細胞同時在激光共聚焦顯微鏡下觀察凋亡細胞的形態(tài)；另外轉(zhuǎn)染細胞進行瑞氏-姬姆薩染色后在普通光學顯微鏡下觀察其形態(tài)變化。
　　 結(jié)果：共轉(zhuǎn)染CDK1、CDK2siRNA后48 小時和60 小時，W

8、esternBlot結(jié)果顯示CDK1和CDK2 蛋白的表達都同時降低。共轉(zhuǎn)染CDK1、CDK2 siRNA后，細胞周期在S 期和G2/M 期都出現(xiàn)阻滯，轉(zhuǎn)染細胞經(jīng)瑞氏-姬姆薩染色后在顯微鏡下可見雙核或多核細胞增多；AnnexinV結(jié)果顯示共轉(zhuǎn)染CDK1、CDK2 siRNA的細胞在48 小時和60 小時都發(fā)生了明顯的凋亡，激光共聚焦顯微鏡下的形態(tài)學觀察也可見到早期凋亡和晚期凋亡的細胞，但westernblot結(jié)果顯示凋亡蛋白Bcl2的含