乙肝病毒X蛋白的穩(wěn)定表達(dá)對(duì)肝細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響及機(jī)制.pdf

1、目的：研究乙肝病毒(HBV)X基因及其產(chǎn)物HBx蛋白對(duì)肝細(xì)胞HL-7702的凋亡和細(xì)胞周期的影響，并探討相關(guān)機(jī)制。 方法：用分子克隆方法構(gòu)建HBV X基因重組質(zhì)粒pcDNA3-X，將其與空質(zhì)粒pcDNA3轉(zhuǎn)入HL-7702細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)G418的篩選構(gòu)建2株新的細(xì)胞株，分別命名為HL-7702-HBx和HL-7702-con。RT-PCR和Western-blot分析證實(shí)HL-7702-HBx細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)HBVX基因。運(yùn)用DNA

2、ladder，流式細(xì)胞分析和電鏡等方法檢測(cè)這兩株細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期情況。并通過(guò)人類(lèi)凋亡和細(xì)胞周期基因芯片分析這兩株細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)基因的差異表達(dá)，最后經(jīng)Real-timePCR和Western-blot進(jìn)一步驗(yàn)證。 結(jié)果：重組質(zhì)粒pcDNA3-X轉(zhuǎn)染后經(jīng)G418篩選，RT-PCR和Western-blot分析結(jié)果顯示HL-7702-HBx細(xì)胞能夠穩(wěn)定表達(dá)HBV X基因。DNA ladder，流式細(xì)胞分析和電鏡觀察顯示與對(duì)

3、照組相比，HL-7702-HBx細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，并有更多的細(xì)胞處于S期。cDNA芯片分析顯示一些DNA修復(fù)基因(XRCC1，DDB1，erc)和細(xì)胞周期點(diǎn)調(diào)控相關(guān)基因(Cdc47，RADl7,etc)參與了這一過(guò)程。cDNA芯片和Real-time PCR結(jié)果顯示HBx可以上調(diào)XRCCl，Cdc47，RAD17 mRNA的表達(dá)，而蛋白印跡實(shí)驗(yàn)卻顯示HBx下調(diào)這三個(gè)基因的蛋白表達(dá)。 結(jié)論通過(guò)抑制DNA修復(fù)和細(xì)胞周期點(diǎn)調(diào)控，HBx蛋白