RNA干擾沉默HOXA5基因表達(dá)及對(duì)Jurkat細(xì)胞周期和凋亡的影響.pdf

1、目的：為探索白血病發(fā)生發(fā)展、增殖及凋亡與HOXA5基因的關(guān)系，本文首先觀察兒童急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋcute lymphoblastic leukemia, ALL）患兒骨髓(homeobox,HOX)A5的表達(dá)情況。在此基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)合成針對(duì)HOXA5基因表達(dá)的小干擾RNA(small interference,siRNA)序列，并測(cè)定其 siRNA的功能,從而構(gòu)建針對(duì) HOXA5shRNA真核表達(dá)載體pRNAT-GFP-Neo-HOX

2、A5,轉(zhuǎn)染人急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株（Jurkat），觀察其對(duì)Jurkat細(xì)胞周期及凋亡的影響，為進(jìn)一步探討白血病的發(fā)生機(jī)制及靶向治療提供理論依據(jù)。方法：1.病例及分組：ALL急性期：ALL初發(fā)25例；ALL緩解期：25例ALL經(jīng)誘導(dǎo)緩解治療達(dá)完全緩解（ALL-CR）組；對(duì)照組：免疫性血小板減少癥（Immune thrombocytopenia, ITP）患兒，共20例。在征得患兒家屬同意的前提下對(duì)樣本進(jìn)行采集。采用淋巴細(xì)胞分離液分離

3、骨髓單個(gè)核細(xì)胞。2.實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（FQ-PCR）和蛋白質(zhì)印記法（Western blot）測(cè)定ALL急性期、ALL緩解期及對(duì)照組（ITP）三組骨髓單個(gè)核細(xì)胞HOXA5mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量。3.根據(jù)HOXA5基因的mRNA序列，設(shè)計(jì)合成三條針對(duì)HOXA5基因不同位點(diǎn)的siRNA序列，并篩選有效干擾HOXA5基因表達(dá)的特異性siRNA序列,構(gòu)建靶向HOXA5的shRNA真核表達(dá)載體pRNAT-GFP-Neo-siHOXA5。4.

4、實(shí)驗(yàn)分組：取對(duì)數(shù)期細(xì)胞（約3x107/ml），將Jurkat細(xì)胞分為三組：實(shí)驗(yàn)組(脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染靶向 HOXA5的 siRNA)、陰性對(duì)照組(脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA)和空白對(duì)照組(僅加等量細(xì)胞及培養(yǎng)基)。5.轉(zhuǎn)染后 FQ-PCR:通過(guò)脂質(zhì)體 LipofectamineTM2000介導(dǎo) siRNA轉(zhuǎn)染 Jurkat細(xì)胞,48h后通過(guò)FQ-PCR和Western blot測(cè)定實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組三組Jurkat細(xì)胞HOXA5mR

5、NA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平。6.流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)：測(cè)定特異性siRNA抑制HOXA5基因表達(dá)后，實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組三組 Jurkat細(xì)胞周期分布和凋亡率的變化。結(jié)果：1 HOXA5mRNA表達(dá)量ALL急性期(0.76±0.05)％顯著高于ALL緩解期(0.48±0.07)%和對(duì)照組(0.47±0.08)%（P<0.05）。ALL急性期（0.70±0.02）HOXA5蛋白表達(dá)量顯著高于ALL緩解期（0.39±0.03）和（ITP

6、）對(duì)照組（0.42±0.02）（P<0.05）。2設(shè)計(jì)并構(gòu)建針對(duì)HOXA5基因的段發(fā)卡RNA(Short hairpin,shRNA)，與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組HOXA5基因的表達(dá)量明顯下降，轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)組各組 Jurkat細(xì)胞基因表達(dá)受抑制，通過(guò)FQ-PCR和 Western blot檢測(cè)出基因沉默效果最好的1條質(zhì)粒，其中序列pRNAT-GFP-Neo-HOXA5C的效果最為顯著。3成功構(gòu)建了有效沉默H O X A5基因的質(zhì)

7、粒表達(dá)載體；與陰性對(duì)照組(0.73±0.003)及空白對(duì)照組(0.73±0.01)相比，實(shí)驗(yàn)組（ pRNAT-GFP-Neo-HOXA5C）H O X A5 m R N A表達(dá)水平(0.17±0.01)較明顯下降（ P<0.05）。與陰性對(duì)照組(1.34±0.06)％和空白對(duì)照組(1.29±0.21)%相比，實(shí)驗(yàn)組（pRNAT-GFP-Neo-HOXA5C）Jurkat細(xì)胞 HOXA5蛋白表達(dá)水平(0.39±0.01)%明顯下降（P<0

8、.05）。4pRNAT-GFP-Neo-siHOXA5C重組載體轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞，與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組Jurkat細(xì)胞G0/Gl期細(xì)胞比例明顯增加(38.69％±2.2％和38.55％±6.0％VS56.70％±6.4％)，S期細(xì)胞比例相應(yīng)下降(48.86%±6.0%和49.53%±8.3%VS29.00%±5.5%)（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率為(24.99±5.16)％，顯著高于陰性對(duì)照組(13.94±O.