survivin基因沉默對HeLa細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期和啟動子甲基化的影響.pdf

1、[目的]：
　　本實驗通過RNAi干擾技術(shù)，構(gòu)建并轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pGP-U6-GFP-SurvivinshRNA至人宮頸癌HeLa細(xì)胞中，抑制內(nèi)源性survivin表達(dá)。觀察沉默survivin基因后對人宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期的影響。初步探討RNAi發(fā)生機制與survivin基因甲基化之間的相關(guān)性。
　　[方法]：
　　根據(jù)RNAi技術(shù)原則，設(shè)計3條survivin基因的siRNA，并合成shRNA的模板，構(gòu)建

2、重組表達(dá)質(zhì)粒。以脂質(zhì)體lipofectaminTM3000轉(zhuǎn)染細(xì)胞，實驗設(shè)置未轉(zhuǎn)染空白對照組，隨機序列NC對照組以及3個pGP-U6-GFP-SurvivinshRNA組。通過實時熒光定量PCR和Western Blot分別檢測轉(zhuǎn)染survivin mRNA表達(dá)水平和蛋白質(zhì)表達(dá)量變化。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率，同時利用Hoechst33258熒光染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)。MSP檢測細(xì)胞survivin啟動子區(qū)CpG島位點甲基化水平

3、變化。
　　[結(jié)果]：
　　1.構(gòu)建的3組重組干擾質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率可達(dá)70％。
　　2.QPCR和Western Blot結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染空白對照組比較，NC組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.059＞0.05)。干擾實驗組內(nèi)源性survivin基因表達(dá)明顯被抑制，其中pGP-U6-GFP-SurvivinshRNA-1效果最佳。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后周期結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周

4、期S期增高(P＜0.05)，伴有G2/M期減低，細(xì)胞周期被阻斷在S期。
　　4.轉(zhuǎn)染后實驗組HeLa細(xì)胞凋亡率顯著高于未轉(zhuǎn)染組。通過Hoechst33258染色觀察，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡特征。
　　5.經(jīng)甲基化特異性PCR檢測轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組與未轉(zhuǎn)染組survivin基因啟動子檢測位點甲基化修飾未發(fā)生改變。
　　[結(jié)論]：
　　重組干擾質(zhì)粒均有效抑制HeLa細(xì)胞中survivin基因表達(dá)，其mRNA表達(dá)量和蛋白質(zhì)表達(dá)水平