siRNA下調LSD1基因影響卵巢癌細胞增殖和細胞周期的實驗研究.pdf

1、研究背景:
　　腫瘤的發(fā)病率和死亡率逐年上升成為危害人類健康的重大挑戰(zhàn)之一[1]。卵巢癌死亡率居婦科惡性腫瘤首位[2]，近年來其發(fā)病率有上升趨勢，嚴重威脅婦女生命健康。雖然在腫瘤細胞減滅術的基礎上輔助化療能有效地改善卵巢癌患者的生存時間，但晚期患者五年生存率仍徘徊在30％左右。因此，尋找新型卵巢癌治療靶點，已成為現(xiàn)實的迫切需要。
　　腫瘤細胞增殖是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要特征之一[3]。組蛋白甲基化是一種重要的可逆性的表觀遺傳修飾

2、方式，參與調控染色質的結構和基因的表達，其甲基化狀態(tài)由組蛋白甲基轉移酶（histone methyltransferases，HMTs）和組蛋白去甲基化酶(histone demethylases，HDMs)共同調節(jié)，研究發(fā)現(xiàn)組蛋白甲基化與去甲基化失平衡與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關[4]。賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1(Lysine specific demethylase1，LSD1)是第一個被發(fā)現(xiàn)的組蛋白去甲基化酶[5]，調控多種基因的轉

3、錄，在多種腫瘤組織中高表達，與腫瘤預后呈負相關[6]，抑制LSD1能抑制腫瘤細胞增殖[7]，表明LSD1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著促進腫瘤細胞增殖的作用。由于表觀遺傳修飾可以導致基因沉默但不伴有基因序列的改變，因此，研究人類疾病表觀修飾機制對疾病的治療具有重要意義。目前有多種組蛋白修飾酶已成為腫瘤治療的重要靶點[8]，LSD1有望成為一種新的抗腫瘤作用的靶標。本實驗通過研究LSD1對卵巢癌細胞增殖和細胞周期的影響及可能機制，為尋求卵巢癌

4、治療的新靶標提供理論基礎。
　　研究目的:
　　利用RNA干擾技術沉默卵巢癌細胞中的LSD1基因，探討其對卵巢癌細胞增殖和細胞周期的影響及可能機制。
　　研究方法:
　　1.LSD1在卵巢癌細胞株中的表達
　　應用免疫印跡法(Western blot)在蛋白水平上檢測4種人卵巢癌細胞株ES-2、HO-8910、SKOV-3和OVCAR-3細胞中LSD1的表達情況。
　　2.細胞轉染
　　采用脂質

5、體介導法將 LSD1-siRNA轉染卵巢癌細胞株，采用實時熒光定量PCR（FQ-PCR）和Western blot分別從 mRNA和蛋白水平檢測轉染前后LSD1的表達。
　　3.沉默LSD1基因對卵巢癌細胞增殖和細胞周期的影響
　　MTT檢測細胞增殖能力，EdU試劑盒檢測細胞DNA合成能力，流式細胞術分析細胞周期。
　　4.沉默LSD1基因后細胞中H3K4me2水平的變化
　　通過Western blot檢測沉默

6、LSD1基因后細胞中H3K4me2的水平。
　　5. LSD1影響卵巢癌細胞增殖和細胞周期的機制研究
　　采用FQ-PCR檢測LSD1沉默后p21、CCNA2的mRNA的表達情況，初步探討LSD1基因對卵巢癌細胞增殖和細胞周期調控的機制。
　　6.統(tǒng)計學分析
　　應用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)結果以-χ±s表示，行方差齊性檢驗和t檢驗，檢驗水準為α＝0.05。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

7、　　結果:
　　1. LSD1在多種卵巢癌細胞中均有表達，細胞株OVCAR-3的LSD1表達水平最高。
　　2. LSD1-siRNA轉染卵巢癌細胞后，F(xiàn)Q-PCR和Western blot檢測顯示，LSD1的表達明顯受抑制，其 mRNA和蛋白表達抑制率分別為78.98%和48.72%，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　3. LSD1-siRNA轉染卵巢癌細胞后，細胞增殖速度減慢，DNA合成能力降低，S期細胞比例

8、降低，G2/M期細胞比例增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　4. LSD1-siRNA轉染卵巢癌細胞后，Western blot結果顯示，細胞中H3K4me2的水平升高，是空白對照組的1.57倍，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　5. LSD1-siRNA轉染卵巢癌細胞后，F(xiàn)Q-PCR結果顯示，p21 mRNA表達升高，是空白對照組的1.36倍；CCNA2 mRNA表達水平較空白對照組下降了68.73%，差異