HIV-1生物性克隆病毒的分離與鑒定及蕨麻提取物體外抗HIV活性研究.pdf

1、目的:由于HIV-1本身具有快速復制及高突變率的特點,在宿主的選擇壓力及藥物的選擇壓力下,HIV感染者體內(nèi)存在高度復雜多樣且動態(tài)變化的病毒準種。目前常用的病毒分離方法均為共培養(yǎng)法,此法分離得到的僅為個體內(nèi)準種中一株或幾株優(yōu)勢毒株,一些相對弱勢株會丟失,不能得到完整的多樣的病毒描繪。目前國外學者已經(jīng)建立了通過有限稀釋共培養(yǎng)獲得生物性克隆HIV-1毒株的方法。本實驗運用有限稀釋共培養(yǎng)方法從我國艾滋病感染者體內(nèi)分離單克隆的HIV-1毒株,旨在

2、豐富及發(fā)展我國HIV的病毒分離方法,并通過分析生物克隆病毒感染、復制能力以及基因序列的變異,驗證分離方法的正確性與可行性。
　　 迄今,被美國FDA批準的抗艾滋病藥物有27種,只有5種藥物用于我國艾滋病患者免費抗病毒治療,耐藥毒株的出現(xiàn)和藥物的毒副作用,導致艾滋病患者抗病毒治療失敗,因此尋找高效、低毒的抗HIV-1的藥物是當前HIV治療中面臨的機遇與挑戰(zhàn),我國具有豐富的植物資源,中草藥在抗HIV中的應用已有廣泛報道。通過研究藏藥

3、蕨麻提取物的抗HIV-1活性以及其對相應細胞的毒性作用,為開發(fā)我國自主產(chǎn)權(quán)的抗艾滋病藥物提供可能。
　　 方法:從新疆及北京HIV-1感染者中選擇治療人群和未治療人群作為樣本,通過有限梯度稀釋感染者外周血單個核細胞(Peripheral bloodmononuclear cells,PBMCs)后進行共培養(yǎng)的方法,根據(jù)分離陽性率來選擇性地分離生物性克隆的HIV-1毒株;利用P24抗原檢測試劑盒定性的檢測病毒分離情況,同時定期定量

4、檢測病毒P24抗原的釋放,分析各生物性克隆的HIV毒株間感染及復制能力的差異,同時擴增培養(yǎng)上清中HIV-1 V1-V5區(qū)基因,并測序分析,比較各生物性克隆的HIV毒株間氨基酸序列的差異及聯(lián)系,從而驗證生物性克隆分離方法的可行性。
　　 藏藥蕨麻提取物由本科室提取,分別用TZM-b1、MT-4和PBMCs檢測提取物的毒性作用,對于TZM-b1和MT-4細胞系,分別采用CCK-8試劑及快速細胞分析儀(CASY-TT)檢測各濃度下細胞

5、的存活數(shù)量,對于PBMCs僅選用CCK-8法檢測,并運用Reed-muench法計算蕨麻提取物對于以上細胞的50％細胞毒性劑量(50％ cytotoxicity concentrations，CC50)。
　　 抗HIV-1活性實驗,分別在TZM-b1、MT-4細胞系和PBMCs進行蕨麻提取物對HIV-1實驗室適應株(SF33)的抑制實驗,用100TCID50(50％Tissue culture infective dose50

6、％組織細胞感染劑量)感染細胞,同時,蕨麻提取物以40,20,10,5,2.5,1.25μg/mL濃度加入細胞,分別在感染3天或7天后,利用熒光和HIV P24檢測試劑盒檢測病毒進入細胞并復制狀況,并運用Reed-muench法計算蕨麻提取物對SF33的半數(shù)抑制濃度(50％inhibitory concentration IC50)。并進一步分析蕨麻提取物對于我國HIV-1臨床分離株和HIV假病毒的抑制作用。
　　 結(jié)果:1、運用

7、有限稀釋共培養(yǎng)法,成功地從個體艾滋病患者PBMCs中分離出多株病毒,實現(xiàn)了微量HIV-1的分離。
　　 2、分離得到的系列病毒,在擴大培養(yǎng)過程中,總體呈增長趨勢,說明采用此法分離的HIV毒株具有感染能力;在相同分離及復制條件下,各病毒在不同時間點產(chǎn)生的P24抗原含量存在差異,說明個體內(nèi)各毒株的感染能力及復制能力具有差異。
　　 3、通過分析病人體內(nèi)毒株間env區(qū)中的V1-V5區(qū)的氨基酸序列,各生物性克隆HIV-1毒株間存

8、在氨基酸的變異、插入及缺失,從基因水平證實了準種理論。
　　 4、采用CCK-8試劑檢測蕨麻提取物對PBMCs的(CC50)為92.5μg/mL,對TZM-b1細胞的CC50為147.5μg/mL,對MT-4上的CC50為163.4μg/mL,使用CASY方法檢測的蕨麻提取物對TZM-b1細胞的CC50為220μg/mL,對MT-4的CC50為.153.9μg/mL。
　　 5、蕨麻提取物在PBMCs和TZM-b1和MT

9、-4細胞上對SF33的IC50分別是IC50分別為和4.02μg/mL、4.67μg/mL和6.17μg/mL;對兩株我國臨床分離株的IC50平均為1.99μg/mL,對于4株HIV假病毒的平均IC50為2.43μg/mL。
　　 結(jié)論:1、采用有限稀釋、梯度稀釋病人PBMCs后共培養(yǎng)方法,根據(jù)各梯度下陽性率,可在某稀釋度下分離得到由單個感染的細胞產(chǎn)生的HIV-1毒株,即生物性克隆的HIV-1毒株
　　 2、個體內(nèi)分離獲