HIV-1p24TaqMan熒光定量檢測系統(tǒng)和HIV-1體外復(fù)制、檢測系統(tǒng)的建立及評價(jià).pdf

1、艾滋病已對全人類的健康造成了嚴(yán)重的威脅。這促使科研工作者奮不顧身投入到艾滋病診治的研究中,并且他們?nèi)〉昧素S碩的成果,但這仍不能有效控制艾滋病在全球的蔓延,因此我們?nèi)孕柙俳釉賲栭_發(fā)更好的診治技術(shù)以遏制艾滋病疫情的發(fā)展。
　　 艾滋病的診斷技術(shù)主要包括:HIV-1 RNA載量檢測、抗體檢測、HIV-1蛋白抗原檢測等技術(shù),它們在艾滋病診斷中起著重要作用。而其中HIV-1 RNA載量檢測技術(shù)最靈敏[1],它在HIV-1窗口期、垂直傳播的

2、早期診斷[2]、HARRT治療病人的病毒復(fù)制監(jiān)測[3]等領(lǐng)域中均可發(fā)揮重要作用。然而,經(jīng)FDA批準(zhǔn)的HIV-1 RNA定量檢測試劑盒價(jià)格昂貴,包括:Roche Amplicor HIV-1 Monitor Test.,version1.5,bioMérieux NucliSens HIV-1 QT Assay,and Versant HIV-1 RNA3.0 Assay(bDNA)[4-10]。國內(nèi)的HIV-1 RNA定量試劑盒也存在價(jià)

3、格偏高的問題。該因素限制了這類試劑盒在我國資源有限地區(qū)的應(yīng)用。此外,國內(nèi)尚無檢測HIV-1 RNA p24載量的TaqMan熒光定量PCR的文獻(xiàn)報(bào)道,因此有必要建立實(shí)驗(yàn)室內(nèi)HIV-1 p24 TaqMan熒光定量PCR檢測系統(tǒng),以此降低艾滋病病毒檢測成本、促進(jìn)的臨床診斷工作。
　　 在艾滋病治療方面:雖有長足進(jìn)步,但仍無根治性的治療方法,亟需創(chuàng)建高通量的、簡便易行的HIV-1體外復(fù)制和檢測系統(tǒng)以用于抗HIV-1有效藥物的篩選,從

4、而加快抗HIV-1藥物的研發(fā)。
　　 本研究分兩部分進(jìn)行:
　　 第一部分:HIV-1熒光定量檢測系統(tǒng)的建立及評價(jià)
　　 第二部分:HIV-1體外復(fù)制、檢測系統(tǒng)的建立及評價(jià)
　　 第一部分:HIV-1 p24 TaqMan熒光定量檢測系統(tǒng)的建立及評價(jià)
　　 目的:
　　 建立檢測HIV-1-p24拷貝的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)系統(tǒng)(HIV-1p24 TaqMan FQ-PCR

5、),并初步探索應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本和臨床樣本檢測。
　　 方法:
　　 通過對H9細(xì)胞進(jìn)行RNA抽提、逆轉(zhuǎn)錄、PCR及載體構(gòu)建的方式得到重組質(zhì)粒pEGFP-N1-p24。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEGFP-N1-p24于293T細(xì)胞、G418篩選、有限稀釋法使其穩(wěn)定表達(dá),從而得到穩(wěn)定表達(dá)p24的陽性對照細(xì)胞株。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄、ELISA、熒光顯微鏡觀察等方法鑒定該pEGFP-N1-p24-293T細(xì)胞株中p24的表達(dá)。以pEGF

6、P-N1-p24模板PCR擴(kuò)增p24及建立標(biāo)準(zhǔn)曲線以及HIV-1 p24 TaqManFQ-PCR系統(tǒng)。用HIV-1 p24 TaqMan FQ-PCR系統(tǒng)、國內(nèi)同類某檢測試劑盒與HIV-1-ELISA試劑盒(Bio-Rad)檢測50份HIV陽性病人外周靜脈血、30份健康人外周靜脈血、50份HBV陽性外周靜脈血及50份HCV陽性外周靜脈血、H9細(xì)胞株,pEGFP-N1-p24293T細(xì)胞株。其中每個標(biāo)本用HIV-1 p24 TaqMan

7、 FQ-PCR系統(tǒng)重復(fù)檢測三次,并設(shè)復(fù)孔。通過與其它試劑盒同時(shí)檢測實(shí)驗(yàn)室及臨床樣本HIV-1 p24載量來驗(yàn)證該檢測系統(tǒng)的可靠性、靈敏性、特異性、穩(wěn)定性等特點(diǎn)。
　　 結(jié)果:
　　 (1)HIV-1-ELISA試劑盒(Bio-Rad)檢測50份HIV-1陽性病人外周靜脈血、H9細(xì)胞株(5.0×105個/ml,0.5ml),pEGFP-N1-p24293T細(xì)胞株(5.0×105個/ml,0.5ml)均為陽性;30份健康人外

8、周靜脈血、50份HBV陽性外周靜脈血及50份HCv陽性外周靜脈血均為HIV-1陰性。
　　 (2)用HIV-1 p24 TaqMan FQ-PCR系統(tǒng)與國內(nèi)同類某HIV-1熒光定量檢測試劑盒檢測50份HIV-1陽性病人外周靜脈血、30份健康人外周靜脈血、50份HBV陽性外周靜脈血及50份HCV陽性外周靜脈血,HIV-1真陽性率為100％,假陽性率0％。說明該檢測系統(tǒng)具有靈敏性、特異性的特點(diǎn)。
　　 (3)HIV-1 p2

9、4 TaqMan FQ-PCR系統(tǒng)與國內(nèi)同類某HIV-1熒光定量檢測試劑盒檢測50份HIV-1陽性病人外周靜脈血檢測的樣本平均值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=0.346,P=0.730＞0.05),兩組檢測值呈線性相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r達(dá)0.986,P＜0.01)。說明該檢測系統(tǒng)檢測結(jié)果可靠。
　　 (4)HIV-1 p24 YaqMan FQ-PCR系統(tǒng)單獨(dú)檢測復(fù)孔間以及獨(dú)立3次對同一標(biāo)本檢測結(jié)果之間變異系數(shù)均小于5.09％說明該檢測系統(tǒng)具有穩(wěn)

10、定的特點(diǎn)。
　　 結(jié)論:
　　 該HIV-1 p24 TaqMan FQ-PCR技術(shù)可靠、靈敏、特異、穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì),并可初步用于實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本和臨床樣本檢測。
　　 第二部分:HIV-1體外復(fù)制、檢測系統(tǒng)的建立及評價(jià)目的:
　　 建立HIV-1體外復(fù)制和檢測系統(tǒng)(JLTRG/H9細(xì)胞混合培養(yǎng)體系)并初步應(yīng)用于抗HIV-1有效藥物篩選。
　　 方法:
　　 JLTRG細(xì)胞與H9細(xì)胞按不同比例混合培

11、養(yǎng)后,通過熒光顯微鏡、流式細(xì)胞技術(shù)分別于24、48、72、96小時(shí)觀察和檢測JLTRG細(xì)胞EGFP的表達(dá)來評估JLTRG細(xì)胞感染程度,并以此確定最優(yōu)感染體系。然后以此最優(yōu)體系來篩選抗HIV-1有效藥物。
　　 結(jié)果:
　　 (1)在JLTRG/H9細(xì)胞混合培養(yǎng)體系中,JLTRG與H9細(xì)胞混合培養(yǎng)比例為10:1時(shí),JLTRG細(xì)胞EGFP表達(dá)量在各個時(shí)間點(diǎn)均為最高,提示此細(xì)胞濃度比例下,JLTRG細(xì)胞的感染效率最高。