腸道菌群失調(diào)致肺部過敏反應(yīng)作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的：支氣管哮喘是兒童最常見的慢性變應(yīng)性疾病，在過去三十年中的發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì)，嚴(yán)重影響了兒童尤其是嬰幼兒的生活質(zhì)量，已成為全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。人體腸道正常菌群對(duì)機(jī)體具有重要的生理意義，臨床上導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)的最常見原因是抗生素的使用。近年來我國各級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)的抗生素濫用現(xiàn)象十分普遍，因而腸道菌群失調(diào)就變得較為常見。人類流行病學(xué)調(diào)查表明在嬰幼兒時(shí)期有抗生素暴露史者則以后發(fā)生哮喘的危險(xiǎn)性增高，相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也提示抗生素所致腸道菌

2、群失調(diào)與變應(yīng)性疾病的發(fā)生相關(guān)。
　　 Th17細(xì)胞是繼Th1、Th2之后新近發(fā)現(xiàn)的第三類效應(yīng)性T細(xì)胞，無論臨床研究還是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，大量結(jié)果均提示Th17在哮喘發(fā)生中起到重要作用。近年來，免疫細(xì)胞的效應(yīng)一調(diào)節(jié)功能失衡亦成為過敏性疾病研究中的重要內(nèi)容，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）亞群的調(diào)節(jié)功能不足，可能是哮喘等變應(yīng)性疾病發(fā)生的重要機(jī)制。此外，樹突細(xì)胞（DC）在機(jī)體免疫系統(tǒng)中處于中心地位。作為一種專職抗原提呈細(xì)胞，DC可經(jīng)其膜表面的Toll

3、樣受體（TLR）等來識(shí)別各種微生物的病原相關(guān)分子模式（PAMP），通過提呈抗原和分泌相應(yīng)細(xì)胞因子，進(jìn)而在指導(dǎo)Th0細(xì)胞分化為Th1、Th2、Th17、Treg細(xì)胞的過程中發(fā)揮了重要作用。
　　 在前期研究基礎(chǔ)之上，我們擬采用卵清蛋白（OVA）霧化吸入氣道激發(fā)，以進(jìn)一步證實(shí)Th2優(yōu)勢(shì)反應(yīng)的發(fā)生；明確在腸道菌群失調(diào)致肺部過敏反應(yīng)過程中是否存在著Th1/Th2/Th17/Treg平衡的失調(diào)；并在腸道菌群失調(diào)狀態(tài)下觀察肺組織中樹突細(xì)胞（

4、DC）功能狀態(tài)的變化情況。本研究結(jié)果將進(jìn)一步闡明T細(xì)胞亞群尤其是Th17/Treg平衡以及樹突細(xì)胞在腸道菌群失調(diào)致肺部過敏反應(yīng)發(fā)生過程中的作用，可為哮喘等變應(yīng)性疾病的防治提供新的思路和理論依據(jù)。
　　 第一部分、卵清蛋白霧化吸入誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)小鼠肺部過敏反應(yīng)的發(fā)生
　　 目的：在抗生素所致腸道菌群失調(diào)小鼠模型基礎(chǔ)上采用卵清蛋白（OVA）直接霧化吸入激發(fā)，探討氣道變應(yīng)性反應(yīng)與腸道菌群失調(diào)的關(guān)系，以期為后續(xù)實(shí)驗(yàn)打下良好的動(dòng)

5、物模型基礎(chǔ)。
　　 方法：將112只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為兩批6組，第一批：菌群失調(diào)Ⅰ組、對(duì)照Ⅰ組；第二批：菌群失調(diào)Ⅱ組、菌群失調(diào)加激發(fā)組、激發(fā)組、對(duì)照Ⅱ組。前2組和后4組小鼠分別于造模第6天和第14天時(shí)取盲腸內(nèi)容物做腸道細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。后4組小鼠在第14天時(shí)還要對(duì)其支氣管肺泡灌洗液（BALF）進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)的變化情況，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺組織中Th1及Th2細(xì)胞水平，并用ELISA法檢測(cè)BALF和血

6、清中OVA特異性IgE的水平。
　　 結(jié)果：與對(duì)照Ⅰ組比較，自由飲用抗生素的小鼠出現(xiàn)腸道菌群失調(diào)，第6天時(shí)腸道細(xì)菌培養(yǎng)未見明顯菌落生長(zhǎng)，在第14天時(shí)腸道菌群失調(diào)仍未恢復(fù)正常。菌群失調(diào)加激發(fā)組小鼠支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞均增加，肺部出現(xiàn)以嗜酸粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺組織黏液分泌明顯增高，BALF中OVA特異性IgE水平顯著增高，肺部Th2細(xì)胞水平增高，Th1細(xì)胞水平與對(duì)照Ⅱ組無差異

7、，但Th1/Th2比值降低。
　　 結(jié)論：抗生素所致腸道菌群失調(diào)小鼠經(jīng)過卵清蛋白霧化吸入激發(fā)后，可產(chǎn)生Th2細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)的變應(yīng)性氣道反應(yīng)，提示抗生素所致腸道菌群失調(diào)可能是誘發(fā)哮喘等變應(yīng)性疾病的危險(xiǎn)因素之一。
　　 第二部分、卵清蛋白氣道激發(fā)對(duì)腸道菌群失調(diào)小鼠T細(xì)胞功能亞群的影響
　　 目的：觀察抗生素所致腸道菌群失調(diào)小鼠經(jīng)OVA氣道激發(fā)后，肺組織和脾臟中T淋巴細(xì)胞功能亞群（Th1/Th2/Th17/treg）之間的

8、相互變化，進(jìn)一步探討腸道菌群失調(diào)致肺部過敏反應(yīng)發(fā)生這一現(xiàn)象在T細(xì)胞水平的作用機(jī)制。
　　 方法：將96只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組，菌群失調(diào)組、菌群失調(diào)加激發(fā)組、激發(fā)組、對(duì)照組，每組24只。于實(shí)驗(yàn)第14天時(shí)用ELISA法檢測(cè)BALF中細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-10的水平，用RT-PCR法檢測(cè)肺組織中特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt和Foxp3兩者的mRNA表達(dá)水平，并采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺組織及脾臟中Th1、T

9、h2、Th17以及CD4+CD25+Foxp3+Treg的水平。
　　 結(jié)果：菌群失調(diào)加激發(fā)組小鼠BMLF中IL-4和IL-17水平增高，而IFN-γ和IL-10水平在各組間比較均無差異。菌群失調(diào)組及菌群失調(diào)加激發(fā)組小鼠肺組織中RORγt mRNA表達(dá)增加，而Foxp3 mRNA表達(dá)降低。菌群失調(diào)加激發(fā)組小鼠肺組織中Th1細(xì)胞水平無變化，而Th2、Th17細(xì)胞水平均增高；脾臟中Th1、Th2、Th17細(xì)胞水平均與對(duì)照組無差異。此

10、外，菌群失調(diào)組及菌群失調(diào)加激發(fā)組小鼠肺組織及脾臟中Treg水平均降低。
　　 結(jié)論：抗生素所致腸道菌群失調(diào)小鼠經(jīng)OVA霧化吸入激發(fā)后，肺部免疫狀態(tài)在mRNA水平發(fā)生了潛在性改變，此外還可產(chǎn)生。Th2、Th17細(xì)胞均占優(yōu)勢(shì)的變應(yīng)性氣道反應(yīng)，這可能與Treg細(xì)胞的產(chǎn)生數(shù)量減少以及調(diào)節(jié)功能不足有關(guān)。
　　 第三部分、腸道菌群失調(diào)小鼠樹突細(xì)胞功能狀態(tài)變化對(duì)肺部過敏反應(yīng)的影響
　　 目的：觀察抗生素所致腸道菌群失調(diào)對(duì)小鼠肺

11、組織中樹突細(xì)胞（DC）成熟度和Toll樣受體2、4的影響，以深入探討OVA氣道激發(fā)引起肺部發(fā)生過敏反應(yīng)在抗原提呈細(xì)胞水平的作用機(jī)制。
　　 方法：將64只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組，菌群失調(diào)組、菌群失調(diào)加激發(fā)組、激發(fā)組、對(duì)照組，每組16只。于實(shí)驗(yàn)第14天時(shí)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺組織中樹突細(xì)胞亞型和成熟度（MHC-Ⅱ類分子）及其膜表面Toll樣受體2、4的表達(dá)水平，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肺組織中TGF-β1、IL-6蛋白的原位表

12、達(dá)情況，并用ELISA法檢測(cè)BALF中TGF-β1、IL-6的產(chǎn)生水平。
　　 結(jié)果：與對(duì)照組和激發(fā)組比較，菌群失調(diào)組及菌群失調(diào)加激發(fā)組小鼠肺組織中樹突細(xì)胞膜表面MHC-Ⅱ類分子及TLR2、4的表達(dá)均增加，但其在后兩組中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與其它3組比較，菌群失調(diào)加激發(fā)組小鼠肺組織中TGF-β1、IL-6蛋白的原位表達(dá)增高，且BALF中TGF-β1、IL-6水平亦同步增加。
　　 結(jié)論：腸道菌群失調(diào)使得肺部樹突細(xì)胞的