鼠源AAFP蛋白對IgE介導(dǎo)小鼠過敏反應(yīng)的干預(yù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的: 通過交聯(lián)過敏細(xì)胞表面的Fc?RI受體和抑制性FcγRIIb受體，可激活FcγRIIb受體的負(fù)調(diào)控信號，信號途徑中5'肌醇磷酸酶（SHIP）的磷酸化使Fc?RI信號途徑中的關(guān)鍵信號分子脾酪氨酸激酶（Syk）脫磷酸化，阻斷Syk啟動的細(xì)胞脫顆粒作用，進(jìn)而阻止過敏反應(yīng)的發(fā)生。據(jù)此，本文構(gòu)建一個鼠源的抗過敏融合蛋白（mouse anti-allergy fusion protein，mAAFP），mAAFP由小鼠IgE Fc段和IgG

2、Fc段融合而成，理論上可同時作用于過敏細(xì)胞表面Fc?RI和Fc?RIIb受體，使其交聯(lián)，達(dá)到抗過敏作用。本文通過探究mAAFP對IgE介導(dǎo)小鼠過敏反應(yīng)的干預(yù)作用及其作用機(jī)制，以期獲得藥效良好作用機(jī)制清晰的結(jié)果，為IgE介導(dǎo)過敏性疾病藥物的研究提供新的方向。
　　方法:
　　（一）融合蛋白mAAFP的構(gòu)建及表達(dá)
　　利用基因工程技術(shù)構(gòu)建mAAFP重組蛋白，并用Invitrogen公司的Flp-InTM CHO表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行

3、蛋白表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物用Protein A親和層析純化，用高效液相色譜技術(shù)（HPLC）分析其純度。
　?。ǘ┤诤系鞍譵AAFP對IgE介導(dǎo)小鼠過敏反應(yīng)的抑制作用及機(jī)制研究
　　1. BALB/c小鼠及FcγRIIb基因缺陷小鼠被動皮膚過敏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)
　　采用BALB/c小鼠及FcγRIIb基因缺陷小鼠被動皮膚過敏反應(yīng)（PCA）模型，通過觀察mAAFP對兩種小鼠PCA反應(yīng)的抑制效果，探究mAAFP對IgE介導(dǎo)過敏反應(yīng)的抑制作

4、用及其作用機(jī)制。
　　2. mAAFP對抗原誘導(dǎo)的體外肥大細(xì)胞脫顆粒時Syk、SHIP磷酸化水平的影響
　　采用抗原致大鼠肥大細(xì)胞（RBL-2H3）脫顆粒模型。用mAAFP處理致敏的RBL-2H3細(xì)胞，過敏原激發(fā)細(xì)胞，分別在2 min、5 min、10 min檢測mAAFP對Syk和SHIP磷酸化水平的影響，進(jìn)一步探討mAAFP的作用機(jī)制。
　?。ㄈ﹎AAFP對花生致小鼠過敏反應(yīng)的干預(yù)作用
　　采用全花生提取物

5、致C57BL/6小鼠及FcγRIIb基因缺陷小鼠過敏模型，以過敏癥狀評分、血漿中組胺的含量、體溫為考察指標(biāo)，探究mAAFP對花生引起的C57BL/6小鼠及FcγRIIb基因缺陷小鼠過敏的干預(yù)效果。
　　（四）mAAFP對卵白蛋白（OVA）致小鼠過敏性哮喘的干預(yù)作用
　　采用卵白蛋白（OVA）致BALB/c小鼠過敏性哮喘模型，以肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞數(shù)目、肺組織病理損傷、氣道高反應(yīng)性（AHR）為考察指標(biāo)，探究mAAFP對OVA致

6、小鼠過敏性哮喘的干預(yù)效果。
　　結(jié)果:
　?。ㄒ唬┤诤系鞍譵AAFP的構(gòu)建及表達(dá)
　　成功構(gòu)建mAAFP蛋白的Flp-InTM CHO穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)。Protein A親和純化后，蛋白產(chǎn)物純度為97.319％，可用于后續(xù)動物實(shí)驗(yàn)研究。
　?。ǘ┤诤系鞍譵AAFP對IgE介導(dǎo)小鼠過敏反應(yīng)的抑制作用及機(jī)制初探
　　1. BALB/c小鼠及FcγRIIb基因缺陷小鼠被動皮膚過敏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)
　　成功構(gòu)建了BAL

7、B/c小鼠及FcγRIIb基因缺陷小鼠被動皮膚過敏（PCA）反應(yīng)模型。在BALB/c小鼠中，mAAFP低、中、高劑量組抑制PCA反應(yīng)率分別為44.5%、65.6%、96%。說明mAAFP對IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)有良好的抑制作用。
　　在FcγRIIb基因缺陷小鼠中，mAAFP低、中、高劑量組對PCA反應(yīng)均無抑制作用，說明mAAFP對PCA反應(yīng)的抑制作用依賴FcγRIIb受體介導(dǎo)的抑制效應(yīng)。
　　2. mAAFP對抗原誘導(dǎo)的體外

8、肥大細(xì)胞脫顆粒時Syk、SHIP磷酸化水平的影響
　　在抗原致大鼠肥大細(xì)胞（RBL-2H3）脫顆粒模型中，無論激發(fā)2min、5min、10min均一致的觀察到mAAFP降低Syk磷酸化水平，升高SHIP磷酸化水平。
　?。ㄈ┤诤系鞍譵AAFP對花生致小鼠過敏反應(yīng)的干預(yù)作用
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明mAAFP顯著減輕小鼠過敏反應(yīng)的臨床癥狀，顯著抑制血漿中組胺的釋放，顯著抑制全花生提取物致敏C57BL/6小鼠體溫的快速下降。說明

9、mAAFP對IgE介導(dǎo)的花生急性過敏反應(yīng)具有抑制作用。但是mAAFP對全花生提取物致敏FcγRIIb基因缺陷小鼠的急性過敏反應(yīng)沒有抑制作用，說明mAAFP在FcγRIIb基因缺失的情況下無法發(fā)揮藥效。
　?。ㄋ模┤诤系鞍譵AAFP對卵白蛋白（OVA）致小鼠過敏性哮喘的干預(yù)作用
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明mAAFP顯著降低了肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞的數(shù)目，明顯改善小鼠肺組織的病理損傷，減輕由OVA誘導(dǎo)的肺組織氣道炎癥。mAAFP緩解了OVA

10、誘導(dǎo)的AHR，提高了肺順應(yīng)性，降低肺阻力。
　　結(jié)論: 結(jié)果表明，mAAFP對小鼠花生過敏及過敏性哮喘均有一定的干預(yù)作用。機(jī)制研究證實(shí)，mAAFP的抗過敏作用是通過交聯(lián)Fc?RI和FcγRIIb受體，促進(jìn)SHIP的磷酸化，使得Fc?RI信號途徑中的關(guān)鍵信號分子Syk發(fā)生脫磷酸化，從而阻斷了Syk啟動的細(xì)胞脫顆粒作用，阻止了過敏反應(yīng)的發(fā)生。
　　該蛋白的療效和作用機(jī)制與設(shè)計思路一致。該蛋白的成功研制，將為IgE介導(dǎo)過敏性疾病的