魚腥草注射劑過敏反應(yīng)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、魚腥草是一種應(yīng)用歷史悠久的傳統(tǒng)中藥,具有抗菌、提高機(jī)體免疫力、抗炎、抗病毒、抗氧化和抗腫瘤等作用。魚腥草的注射劑臨床應(yīng)用廣泛,但不良反應(yīng)較為突出,報(bào)道最多的是過敏反應(yīng),包括過敏性休克等嚴(yán)重過敏反應(yīng),嚴(yán)重危害了患者的健康和生命,同時(shí)影響了其臨床應(yīng)用,因此探討該類藥物的過敏反應(yīng)機(jī)制已成為迫切的研究課題。魚腥草的注射劑主要包括魚腥草注射液和注射用新魚腥草素鈉,魚腥草注射液含48種成分,其中魚腥草素(Houttuynin,HOU)為其主要藥效成

2、分;注射用新魚腥草素鈉僅含單一成分新魚腥草素(Neohouttuynin,NEO)。兩種注射劑所致的過敏反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制迄今尚無報(bào)道,一般認(rèn)為可能與魚腥草素和新魚腥草素有關(guān)。因此,本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究魚腥草素和新魚腥草素在魚腥草注射劑致過敏反應(yīng)中的作用及機(jī)制。小分子抗原通過與載體蛋白耦聯(lián)才能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng),用小分子化學(xué)物質(zhì)封閉其與蛋白發(fā)生耦連反應(yīng)的基團(tuán)可能防止過敏反應(yīng)的發(fā)生。因此,本實(shí)驗(yàn)嘗試用小分子化學(xué)物質(zhì)封閉魚腥草素與蛋白發(fā)生耦連反

3、應(yīng)的羥基,檢測(cè)被封閉后產(chǎn)物的藥效,嘗試解決魚腥草注射劑的過敏反應(yīng)問題。本實(shí)驗(yàn)建立了魚腥草素和新魚腥草素致豚鼠過敏反應(yīng)模型,并探討了過敏反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制,以求為過敏反應(yīng)的防治提供有效措施。材料與方法1.魚腥草素和新魚腥草素全抗原的制備采用牛血清白蛋白(Bovine serumalbumin,BSA)和人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA)作為載體蛋白,與魚腥草素和新魚腥草素耦連制備全抗原,采用紫外掃描鑒定合成的全抗原

4、。2.豚鼠過敏反應(yīng)模型的建立豚鼠40只,體重200g~250g,雌雄各半,隨機(jī)均分為魚腥草素組、新魚腥草素組、陰性對(duì)照組和陽性對(duì)照組。魚腥草素組和新魚腥草素組第1天分別腹腔注射HOU-BSA和NEO-BSA加等量弗氏佐劑,第3,5.天分別注射HOU-BSA和NEO-BSA致敏,于第23天耳緣靜脈注射HOU-HSA和NEO-HSA激發(fā);陰性對(duì)照組第1天腹腔注射BSA加等量弗氏佐劑,第3,5天注射BSA,于第23天耳緣靜脈注射HSA;陽性對(duì)

5、照組第1,3,5天注射卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)致敏,于第23天耳緣靜脈注射OVA激發(fā)。觀察激發(fā)后過敏反應(yīng)癥狀,取發(fā)生過敏反應(yīng)致死豚鼠的肺、肝組織制作病理切片,顯微鏡下觀察。3.致敏豚鼠血清特異性IgE和IgG抗體豚鼠12只,隨機(jī)均分為魚腥草素組和新魚腥草素組,分別于第11、15、19、23、27、31、35天心臟采血,制備血清備用。采用PCA測(cè)定特異性抗體產(chǎn)生的規(guī)律,鑒定特異性抗體的類型;采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定實(shí)驗(yàn)(Enzy

6、me-linked immunospecific assay,ELISA)檢測(cè)豚鼠血清中特異性IgG抗體。4.肥大細(xì)胞脫顆粒和離體回腸收縮實(shí)驗(yàn)采用被動(dòng)肥大細(xì)胞脫顆粒實(shí)驗(yàn)觀察正常豚鼠腹腔肥大細(xì)胞(Peritoneal mast cell,PMC)與致敏血清共孵育并用抗原液激發(fā)后觀察PMC脫顆粒情況并計(jì)算脫顆粒率。采用離體回腸實(shí)驗(yàn)觀察致敏豚鼠離體回腸被攻擊后收縮情況。5.魚腥草素化學(xué)結(jié)構(gòu)的改造為消除魚腥草素的過敏原性,采用乙二胺封閉魚腥草素

7、引發(fā)過敏反應(yīng)的羥基,并用抗菌試驗(yàn)測(cè)定封閉后產(chǎn)物的藥效學(xué)變化。6.魚腥草注射劑的抗菌效應(yīng)魚腥草注射液的臨床常用量為12.6μg·kg-1(以其中魚腥草素的含量表示),為注射用新魚腥草素鈉的6.3％。本實(shí)驗(yàn)探討了兩者臨床用量相差較大的原因,以確定其臨床應(yīng)用的合理性。6.1體外抗菌效應(yīng)檢定菌:金黃色葡萄球菌(G070601-3),河南省藥品生物制品檢定所;培養(yǎng)基:培養(yǎng)基Ⅱ,按2005版藥典配制;方盤制法:將200ml培養(yǎng)基(含0.01%菌原液

8、)平鋪于大方盤,以不銹鋼打孔器打孔,加樣后于37℃培養(yǎng)18h,測(cè)定樣本抑菌圈直徑。6.2體內(nèi)抗菌效應(yīng)小鼠尾靜脈注射不同濃度金葡菌菌液,以剛能引起小鼠全部死亡的菌液量作為最小致死量(Minimal lethal dose MLD)菌液。小鼠尾靜脈注射MLD菌液制造小鼠感染模型,腹腔注射魚腥草素、注射用新魚腥草素鈉和魚腥草注射液進(jìn)行治療,對(duì)照組注射等體積生理鹽水,觀察和統(tǒng)計(jì)給菌后7天內(nèi)各組動(dòng)物死亡率,用Bliss法計(jì)算三種藥物的ED25。7

9、.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS10.0軟件,對(duì)各項(xiàng)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料兩組比較分別采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、配對(duì)資料t檢驗(yàn)、Spearman相關(guān)性檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)a為0.05。結(jié)果1.魚腥草素及新魚腥草素全抗原的制備紫外掃描圖譜顯示,耦聯(lián)產(chǎn)物在280nm處特征性吸收峰明顯增強(qiáng),提示魚腥草素、新魚腥草素分別與牛血清蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)耦聯(lián)成功。2.豚鼠過敏反應(yīng)模型的建立魚腥草素組和新魚腥草素組豚鼠激發(fā)后,部分動(dòng)物迅速發(fā)生呼吸困

10、難、翻滾臥倒、小便失禁甚至死亡等休克癥狀,兩致敏組過敏反應(yīng)發(fā)生率分別為80%和90%,休克發(fā)生率分別為20%和50%,死亡率分別為20%和40%。肺組織HE染色顯示:兩致敏組肺組織淤血,肺水腫合并肺氣腫,肺泡壁破壞嚴(yán)重,同時(shí)伴有廣泛的炎細(xì)胞浸潤。肝組織HE染色顯示:兩致敏組肝組織水腫明顯,有部分肝細(xì)胞胞膜破裂,并伴有炎癥細(xì)胞浸潤。肝肺組織病理變化表明,發(fā)生過敏反應(yīng)致死的豚鼠均呈現(xiàn)典型的過敏性休克特征。3.致敏豚鼠血清特異性IgE和IgG

11、抗體采用PCA分別測(cè)定魚腥草素及新魚腥草素組致敏豚鼠血清抗體產(chǎn)生的規(guī)律性,兩組豚鼠均是第一次致敏后第15天開始檢測(cè)出抗體,第23天達(dá)到高峰,之后逐漸降低。經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),兩實(shí)驗(yàn)組抗體效價(jià)與過敏反應(yīng)分級(jí)均呈顯著性相關(guān)(P<0.01)。用加熱滅活后的血清致敏24h后激發(fā)PCA反應(yīng)陽性,72h后激發(fā)PCA反應(yīng)陰性,而同時(shí)注入體內(nèi)的非滅活血清72h后激發(fā)PCA反應(yīng)陽性,說明兩致敏組豚鼠體內(nèi)同時(shí)存在IgE和IgG型特異性抗體。經(jīng)Spearm

12、an相關(guān)性分析,IgE和IgG抗體效價(jià)之間無相關(guān)性(P>0.05)。采用ELISA檢測(cè)了豚鼠血清特異性IgG抗體,魚腥草素組、新魚腥草素組和正常豚鼠分別為0.36±0.18、0.51±0.19和0.15±0.07。獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)結(jié)果表明,兩致敏組IgG抗體水平均高于正常對(duì)照組(P<0.05);經(jīng)Spearman相關(guān)性分析,ELISA所測(cè)特異性IgG水平與PCA所測(cè)特異性IgG效價(jià)之間存在相關(guān)性(P<0.05)。4.肥大細(xì)胞脫顆粒和離體回

13、腸收縮實(shí)驗(yàn)致敏血清原液處理并經(jīng)抗原攻擊后,有大量肥大細(xì)胞膜不完整,顆粒脫出胞外,陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組、魚腥草素組和新魚腥草素組的脫顆粒率分別為(29.2±6.61)、(70.4±12.5)%、(63.6±7.5)%和(70.8±13.6)%。經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),兩實(shí)驗(yàn)組肥大細(xì)胞脫顆粒率均顯著高于陰性對(duì)照組(P<0.01),與陽性對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。魚腥草素組與新魚腥草素組的致敏離體回腸經(jīng)抗原攻擊后,腸管收縮明顯增

14、強(qiáng);若在攻擊前加入苯海拉明,則離體回腸無明顯收縮。5.魚腥草素化學(xué)結(jié)構(gòu)的改造采用乙二胺封閉魚腥草素與血清蛋白發(fā)生反應(yīng)的羥基后測(cè)定封閉后產(chǎn)物的抗菌活性。結(jié)果顯示,封閉后的魚腥草素雖表現(xiàn)為一定的抗菌活性,但抗菌活性較反應(yīng)前明顯降低,說明采用該方法雖可能降低魚腥草素的過敏原性,但影響其藥效的發(fā)揮。6.魚腥草注射劑的抗菌效應(yīng)6.1體外抗菌效應(yīng)魚腥草素低濃度組(相當(dāng)于魚腥草注射液中魚腥草素的濃度)與魚腥草素注射液組均未出現(xiàn)抗菌效應(yīng),而魚腥草素高濃

15、度組(相當(dāng)于魚腥草注射液中魚腥草素濃度的4倍)出現(xiàn)抗菌效應(yīng),說明魚腥草注射液中魚腥草素的含量較低,體外抗菌活性較差。6.2體內(nèi)抗菌效應(yīng)魚腥草素、注射用新魚腥草素鈉和魚腥草注射液的ED25分別為4.58、4.29和0.56 mg·kg-1。結(jié)果顯示,在達(dá)到同樣藥效(保護(hù)25%的敗血癥小鼠存活)時(shí),魚腥草注射液的用量僅為魚腥草素和注射用新魚腥草用量的12.2%和13.1%。體外和體內(nèi)抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:魚腥草注射液中除魚腥草素外的其它成分在體