藥用紅樹植物白骨壤抗補(bǔ)體免疫活性多糖的研究.pdf

1、紅樹是一種寶貴的藥用植物資源，具有潛在的開發(fā)利用前景，但是它的藥用價(jià)值在我國一直未得到重視。白骨壤又名海欖雌，為馬鞭草科海欖雌屬植物，是世界上分布最廣的紅樹植物之一。同時(shí)又是中國紅樹林最大的種群，資源十分豐富。該植物在我國和亞洲許多國家一直被用于治療皮膚病、風(fēng)濕和潰瘍等疾病。近年來，白骨壤植物的藥用價(jià)值引起廣泛關(guān)注和研究，但是國內(nèi)外對(duì)白骨壤活性成分的研究僅限于萜類、類黃酮和甾醇等低極性的小分子物質(zhì)，對(duì)活性多糖的研究迄今尚未見報(bào)道，本文首

2、次對(duì)白骨壤植物多糖的制備、結(jié)構(gòu)特征以及抗補(bǔ)體活性進(jìn)行了研究，這對(duì)于揭示白骨壤多糖結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系、合理開發(fā)利用我國的紅樹林資源具有重要的學(xué)術(shù)意義和應(yīng)用價(jià)值，其主要的研究內(nèi)容如下： 采用三種溶劑提取法和體外抗補(bǔ)體活性篩選模型對(duì)民間藥用紅樹植物：木欖、老鼠簕和白骨壤的初提物進(jìn)行活性篩選，結(jié)果表明白骨壤水提物具有較強(qiáng)的抗補(bǔ)體活性。紫外光譜學(xué)分析表明，白骨壤的活性成分可能為多糖類物質(zhì)。采用乙醇、冷水和熱水對(duì)白骨壤中的成分分步進(jìn)行提取及制

3、備，共得到4種提取物。結(jié)合得率和體外抗補(bǔ)體活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從中篩選獲得活性最強(qiáng)組分～熱水提取的水溶性粗多糖HAM-0。 化學(xué)分析表明HAM-0主要由多糖、蛋白質(zhì)和灰分組成，對(duì)HAM-0分別采用蛋白酶水解和高碘酸氧化處理，并測定其產(chǎn)物的抗補(bǔ)體活性，可以初步認(rèn)為多糖的糖鏈結(jié)構(gòu)對(duì)其活性起決定性作用。 考察了不同原料來源對(duì)多糖含量的影響，宜選擇秋季的老枝為提取原料。采用正交實(shí)驗(yàn)分析方法優(yōu)化了白骨壤的提取工藝，得出水提法的最佳工藝參

4、數(shù)為：浸提時(shí)間2 h，浸提溫度100℃，提取2次，料水比1:40。在該工藝條件下制備的白骨壤多糖HAM-O經(jīng)超濾法分級(jí)、三氯乙酸法脫蛋白質(zhì)和DEAE-纖維素脫色處理，得多糖組分HAM-3-Ⅱ，純度達(dá)95％左右。 通過DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析和Sephacryl S-400凝膠柱層析對(duì)白骨壤多糖組分HAM-3-Ⅱ進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，并結(jié)合體外抗補(bǔ)體功能追蹤活性部分，最終分離得到兩種純化的活性多糖

5、組分，HAM-3-Ⅱa和HAM-3-Ⅱb-Ⅱ，其中HAM-3-Ⅱb-Ⅱ?yàn)橹饕M分，并且活性最高，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)它們的生物活性不是由于純化過程中所產(chǎn)生的微生物所造成的。 進(jìn)一步分析表明，HAM-3-Ⅱa為中性糖蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為97600，蛋白含量為4.9 g·100g<'-1>，多糖含量為95.0 g·100g<'-1>，多糖以O(shè)-糖肽鍵與蛋白相結(jié)合；糖鏈由鼠李糖(Rha)、木糖(Xyl)和半乳糖(Gal)組成，肽鏈上含有絲氨酸、

6、蘇氨酸和脯氨酸，未檢出羥賴氨酸和羥脯氨酸。HAM-3-Ⅱb-Ⅱ?yàn)樗嵝怨z類多糖，糖鏈主要由半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖和半乳糖醛酸組成，其中25％半乳糖醛酸被酯化，其相對(duì)分子質(zhì)量為105200。采用剛果紅實(shí)驗(yàn)研究了HAM-3-Ⅱb-Ⅱ多糖組分在水溶液中的構(gòu)象，結(jié)果表明多糖存在無規(guī)卷曲構(gòu)象。原子力顯微鏡(AFM)對(duì)多糖溶液的立體形貌進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)多糖聚集成大小不等的圓球狀顆粒。掃描電鏡(SEM)研究了多糖的固態(tài)形貌，結(jié)果顯示該多糖以無定形為主

7、。 采用高碘酸氧化、Smith 降解、部分酸水解、甲基化分析和核磁共振等方法對(duì)白骨壤多糖組分HAM-3-Ⅱb-Ⅱ的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示HAM-3-Ⅱb-Ⅱ?yàn)榈湫偷氖罄畎肴樘侨┧峋厶荌型酸性果膠類多糖，主鏈骨架包括1，4-連接的α-D-GalpA構(gòu)成的無分支的半乳糖醛酸聚糖(光滑區(qū))和通過α-D-GalpA的O-4位與1，2-、1，2,4-L-Rhap的O-2交替相連構(gòu)成的含有較多分支的鼠李半乳糖醛酸聚糖(毛發(fā)區(qū))。T-、1，6

8、-、1，3,6-、1，4-、1，4,6-DGalp和T-、1，2-、1，3-、1，5-、1，2,5-、1，3,5-Araf聚合成的阿拉伯半乳聚糖、半乳聚糖以及阿拉伯聚糖，構(gòu)成了HAM-3-Ⅱb-Ⅱ的支鏈部分，通過Rha殘基的O-4位與主鏈相連。 對(duì)白骨壤酸性果膠多糖HAM-3-Ⅱb-Ⅱ的構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行了初步探討，結(jié)果顯示多糖的中性糖支鏈對(duì)活性表達(dá)起決定性的作用，酯化度以及半乳糖醛酸聚糖對(duì)多糖組分的抗補(bǔ)體活性有一定影響。 對(duì)

9、HAM-3-Ⅱb-Ⅱ組分進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，結(jié)果表明該多糖無性毒性反應(yīng)。體外活性檢測采用細(xì)胞培養(yǎng)法，結(jié)果表明HAM-3-Ⅱb-Ⅱ在體外能夠顯著增強(qiáng)由LPS誘導(dǎo)的小鼠脾B淋巴細(xì)胞的增殖，但是對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾T淋巴細(xì)胞的增殖效果不明顯。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)從非特異性免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫三個(gè)方面研究了多糖的免疫調(diào)節(jié)活性，結(jié)果表明多糖具有提高免疫器官指數(shù)、巨噬細(xì)胞的吞噬能力、提高血清溶血素活性和補(bǔ)體C3含量、促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的增殖，對(duì)T淋巴細(xì)胞有一定