補(bǔ)體抑制活性馬勃多糖的純化及結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、補(bǔ)體系統(tǒng)(complement system)是對(duì)病原體的識(shí)別有效地轉(zhuǎn)化為宿主對(duì)最初感染發(fā)揮防御功能的主要機(jī)制之一,其活化后完成對(duì)病原體的調(diào)理、聚集炎癥細(xì)胞及形成膜攻擊復(fù)合物(MAC)殺死病原體等作用。然而補(bǔ)體系統(tǒng)的非正常激活則會(huì)引起人體免疫系統(tǒng)的過(guò)度反應(yīng),造成正常組織的損傷,且此非正常激活參與多種疾病的病理過(guò)程,臨床上目前尚無(wú)理想的治療藥物。近年來(lái),本課題組致力于中藥有效成分與補(bǔ)體抑制關(guān)系的研究,分離得到一些高效、低毒的小分子及均一的

2、多糖類天然補(bǔ)體抑制物質(zhì),初步研究了中藥抗補(bǔ)體活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。本課題主要通過(guò)活性導(dǎo)向分離技術(shù),對(duì)擔(dān)子菌門(mén)真菌馬勃的多糖進(jìn)行了分離純化,對(duì)得到的均一多糖進(jìn)行了初步的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)研究,并對(duì)其對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)的作用進(jìn)行了靶點(diǎn)的研究。
　　均一多糖的分離純化:馬勃菌體經(jīng)過(guò)醇提后,殘?jiān)?jīng)0.02mol/L氫氧化鈉溶液提取,對(duì)其提取液進(jìn)行醇沉,沉淀通過(guò)三氯乙酸除去游離蛋白,透析除去小分子后得到總多糖(經(jīng)典途徑抗補(bǔ)體活性IC50=20.10ug/ml

3、)。總多糖經(jīng)過(guò)DEAE-cellulose柱色譜進(jìn)行初步分離,以0-2mol/L的氯化鈉洗脫得到5部分,其中水、0.8和2mol/L氯化鈉洗脫部分無(wú)活性,0.4mol/L氯化鈉洗脫部分(經(jīng)典途徑抗補(bǔ)體活性IC50=77.88ug/ml)1.2mol/L氯化鈉洗脫部位(經(jīng)典途徑抗補(bǔ)體活性IC50=83.24ug/ml)有較好的活性。這兩活性部位通過(guò)SephacrylTMS-300及SephacrylTMS-200凝膠柱色譜進(jìn)一部純化,最終

4、分離出四個(gè)具有抗補(bǔ)體活性的均一多糖,命名為T(mén)FP-1、TFP-2、TFP-3和TFP-4。
　　均一多糖的抗補(bǔ)體活性測(cè)試及作用機(jī)理研究:研究了四個(gè)均一多糖對(duì)補(bǔ)體激活經(jīng)典和旁路途徑的抑制作用,結(jié)果表明:TFP-1、TFP-2、TFP-3和TFP-4在經(jīng)典途徑的測(cè)試中,IC50分別為181.7±14.45ug/ml、132.7±13.70ug/ml、78.81±3.21ug/ml、136.1±11.60ug/ml;在旁路途徑的IC50

5、分別為162.45±23.90ug/ml、142.76±20.70ug/ml、136.23±10.60ug/ml、139.1±11.60ug/ml。從結(jié)果可知:四個(gè)均一多糖均具有較好的抗補(bǔ)體活性,但較粗多糖已經(jīng)有較大幅度的降低。通過(guò)抗補(bǔ)體靶點(diǎn)的檢測(cè)實(shí)驗(yàn),我們對(duì)這四個(gè)均一多糖的作用機(jī)理進(jìn)行了初步的研究。這四個(gè)均一多糖作用靶點(diǎn)一致,均作用于補(bǔ)體激活途徑中的C1q,C2,C3,C4,C5和C9成分。
　　均一多糖的結(jié)構(gòu)研究:均一多糖TF

6、P-1為棕褐色疏松絮狀,分子量約為500kDa,總糖含量為96.94％;還含有微量的糖醛酸和蛋白質(zhì)。完全酸水解得到3種單糖,糖基摩爾比為:葡萄糖Glc:甘露糖Man:半乳糖Gal=6.30:1.03:2.07。甲基化結(jié)果顯示含Terminal Glcp、1,3-linked Galp、1,2-linked Manp、1,3-linked Glcp、1,6-linked Glcp和1,2,3,6-linked Glcp摩爾比為28.48:

7、10.31:26.69:25.86:8.21:8.25。均一多糖TFP-2亦為棕褐色絮狀,,分子量超過(guò)500kDa,總糖含量為97.24％;還含有微量的糖醛酸和蛋白質(zhì)。完全酸水解得到3種單糖,糖摩爾比為葡萄糖Glc:甘露糖Man:半乳糖Gal=8.68:0.69:0.63。甲基化結(jié)果顯示含Terminal Glcp,1,3-linked Galp,1,2-linked Manp,1,3-linked Glcp,1,6-linked Gl

8、cp,1,2,3,6-linked Glcp摩爾比為14.42:6.27:9.71:30.85:34.03:8.75。均一多糖TFP-3為棕黃色絮狀,,分子量約為600kDa,總糖含量為95.24％。完全酸水解得到3種單糖,糖摩爾比為葡萄糖Glc:甘露糖Man:半乳糖Gal=7.46:1.25:1.29。甲基化結(jié)果顯示TFP-3含有1,3-linked Galp、1,2-linked Manp、Terminal Glcp、1,3,6-l

9、inked Glcp、1,2,3,6-linked Glcp和1,4-linked GlcpNAC,比例為0.132:0.120:0.402:0.261:0.075。且TFP-3含有約9％ Terminal GlcpA。在結(jié)構(gòu)研究中,結(jié)合TFP-3的甲基化結(jié)果及它的一維(1H,13C)和二維(HMBC,HMQC,TOCSY)核磁譜圖,實(shí)驗(yàn)對(duì)他們的化學(xué)位移進(jìn)行了歸屬并得出了他主要的重復(fù)單元是以1,3,6-linked Glcp、1,2,3

10、,6-linked Glcp和1,2-linked Manp為主鏈, Terminal Glcp、Terminal GlcpA和1,3-linked Galp為側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)。均一多糖TFP-4為淺藍(lán)色絮狀,,分子量約為1000kDa,總糖含量為56.94％;糖醛酸含量47.95％,蛋白質(zhì)含量為34.89％。還原后完全酸水解得到3種單糖組成的,糖殘基摩爾比為:葡萄糖Glc:甘露糖Man:半乳糖Gal=5.886:1.222:2.894,由于