人LMP-1基因的腺病毒重組體構建及在BMSCs的表達.pdf

1、目的：應用AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)，構建人LMP-1基因的腺病毒重組體，感染體外培養(yǎng)的兔BMSCs，鑒定細胞對LMP-1的表達情況，為進一步動物實驗奠定基礎。 方法：采用PCR的方法以pIRES2-EGFP-LMP-1質粒為模板進行擴增，在下游引物中加入特定序列，使擴增出的LMP-1基因帶有編碼6個組氨酸(即His標簽)的堿基序列。將得到的帶有His標簽堿基序列的LMP-1基因作為目的基因，通過TA克隆與pMD18-T載體連接

2、并測序。雙酶切后插入至腺病毒穿梭質粒pAdirack-CMV內。Pme Ⅰ線性化陽性克隆pAdtrack-LMP-1，在BJ5183菌內完成與骨架質粒pAdeasy-1的同源重組，構建出重組腺病毒質粒pAd-LMP-1。通過脂質體介導在HEK293細胞內包裝出復制缺陷的重組腺病毒Ad-LMP-1，大量擴增、純化并測定滴度。 結合骨髓密度梯度離心法和貼壁篩選法從兔骨髓中分離培養(yǎng)BMSCs。重組腺病毒以不同的MOI感染第三代BMSC

3、s，在顯微鏡下觀察其生長情況及感染效率。然后以最佳MOI感染BMSCs，3天后收集細胞行RT-PCR法檢測LMP-1基因的mRNA表達，再利用抗His標簽的特異抗體以Western Blot的方法鑒定LMP-1基因的蛋白表達。 結果：測序鑒定攜帶His標簽的LMP-1基因的重組質粒pMD18-T構建成功。成熟的體外分離培養(yǎng)BMSCs的方法方便簡單，收獲細胞數(shù)量多且增殖能力強。重組腺病毒以150的MOI值感染兔BMSCs可以獲得最