攜帶IKK2dn基因重組腺病毒載體的構(gòu)建及表達(dá)驗(yàn)證.pdf

1、目的：(1)構(gòu)建用于真核細(xì)胞表達(dá)的重組腺病毒載體pAdxsi-GFP-IKK2dm；(2)將其包裝成腺病毒顆粒，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)染哺乳細(xì)胞hela并驗(yàn)證其在細(xì)胞中表達(dá)，為進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)IKK2dn基因在同種異體器官移植中誘導(dǎo)免疫耐受，保護(hù)移植物的作用奠定基礎(chǔ)。方法：(1)將pACCMVpLpASR(+)-IKK2dn基因與pShuttle-GFP-CMV(-)TEMP重組穿梭載體經(jīng)KpnⅠ/HindⅢ酶切，回收和純化。T4DNA連接酶進(jìn)行連接后

2、轉(zhuǎn)化為感受態(tài)細(xì)胞DH5a，丁胺卡那霉素篩選。提取單克隆菌落，作酶切鑒定，抽取陽性菌落即得到pShuttle-GFP-CMV(-)TEMP-IKK2dn重組穿梭載體質(zhì)粒。(2)將重組穿梭載體質(zhì)粒pShuttle-GFP-CMV(-)TEMP-IKK2dn與重組腺病毒載體質(zhì)粒pAdxsi經(jīng)I-CeuⅠ+I-SceⅠ雙酶切處理，回收和純化。T4DNA連接酶進(jìn)行連接后轉(zhuǎn)化為感受態(tài)細(xì)胞DH5a，氨芐青霉素篩選。提取單克隆菌落，作酶切鑒定，抽取陽性

3、菌落即得到pAdxsi-GFP-IKK2dn病毒質(zhì)粒以用于病毒包裝。(3)脂質(zhì)體法將重組腺病毒載體pAdxsi-GFP-IKK2dn和Lipofectamine2000脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染于人胚腎細(xì)胞系的293T細(xì)胞。觀察細(xì)胞出毒跡象并進(jìn)行包裝，收毒，凍融，擴(kuò)增，再收毒并作毒種鑒定后以離心，透析方法純化腺病毒進(jìn)行滴度測定及檢測。(4)并將腺病毒顆粒轉(zhuǎn)染哺乳細(xì)胞hela并驗(yàn)證其在細(xì)胞中表達(dá)。 結(jié)果：(1)得到7.4kbp的Shuttle-

4、GFP-CMV(-)TEMP-IKK2dn重組穿梭載體質(zhì)粒。(2)腺病毒載體pAdxsi-GFP-IKK2dn序列測定結(jié)果正確。(3)最后獲得的腺病毒載體滴度為2×1011PFU/ml。(4)RT-PCR驗(yàn)證腺病毒顆粒成功轉(zhuǎn)染哺乳細(xì)胞hela，可供進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究需要。 結(jié)論：(1)成功構(gòu)建Shuttle-GFP-CMV(-)TEMP-IKK2dn重組穿梭載體質(zhì)粒。(2)成功構(gòu)建攜帶IKK2dn基因重組腺病毒載體pAdxsi-GF