IFIT1調(diào)控趨化因子表達(dá)在狼瘡臟器損害中的機(jī)制研究.pdf

1、背景：Ⅰ型干擾素及其誘導(dǎo)的信號(hào)通路和相關(guān)蛋白是SLE新的致病通路。IFIT1(Interferoninducedproteinwithtetratricopeptiderepeats1)為干擾素誘導(dǎo)下表達(dá)量最為豐富的基因，不僅在狼瘡?fù)庵苎狿BMC中表達(dá)明顯上調(diào)，而且在狼瘡腎炎組織中的表達(dá)量也顯著增高，被認(rèn)為是狼瘡易感基因。本研究室以往發(fā)現(xiàn)IFIT1可能通過與Rho/Rac鳥嘌呤核苷交換因子相互作用，活化Rho蛋白，參與SLE的免疫應(yīng)答過

2、程。但其在SLE中具體的下游效應(yīng)及致病機(jī)制尚未明確。 目的： 探尋IFIT1調(diào)控免疫細(xì)胞趨化因子表達(dá)在SLE臟器損害中的作用，進(jìn)一步明確其分子機(jī)制及信號(hào)通路，為勾畫IFIT1在SLE中的致病通路提供理論基礎(chǔ)，也將為后續(xù)治療開辟新思路。 方法： 1.檢測(cè)人IFIT1對(duì)淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞趨化因子IL-8表達(dá)的調(diào)控作用。培養(yǎng)人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株JurkatE6.1，電轉(zhuǎn)染法瞬時(shí)過表達(dá)IFIT1；慢病毒載體介

3、導(dǎo)的基因沉默技術(shù)下調(diào)IFIT1的表達(dá)。在正反兩個(gè)體系中以抗CD3和CD28單克隆抗體刺激細(xì)胞，Realtime-PCR和ELISA法分別檢測(cè)IFIT1對(duì)活化的淋巴細(xì)胞趨化因子IL-8mRNA及蛋白水平的影響。同時(shí)采用慢病毒載體在THP-1細(xì)胞系中建立IFIT1基因沉默體系，Realtime-PCR和ELISA法觀察IFIT1下調(diào)對(duì)LPS刺激活化的單核細(xì)胞IL-8表達(dá)的影響。 2.探尋IFIT1對(duì)IL-8調(diào)控作用的分子機(jī)制。熒光素

4、酶報(bào)告基因分析IFIT1對(duì)IL-8啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控作用。Western-blot和EMSA檢測(cè)IFIT1對(duì)活化的淋巴細(xì)胞MAPK和NF-kB信號(hào)通路活化的影響。進(jìn)一步應(yīng)用特異性信號(hào)通路抑制劑阻斷，ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-8的蛋白水平。 3.Realtime-PCR技術(shù)檢測(cè)IFIT1和IL-8在SLE患者外周血白細(xì)胞的表達(dá)水平，分析兩者間的相關(guān)性，并與相應(yīng)臨床資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。免疫組化技術(shù)檢測(cè)狼瘡腎炎患者腎組織IF

5、IT1、IL-8及p-p38的表達(dá)情況。 4.進(jìn)一步對(duì)小鼠IFIT1基因(musIFIT1)在狼瘡鼠模型中的表達(dá)及功能進(jìn)行研究。RealtimePCR法檢測(cè)musIFIT1及趨化因子CXCL2、MIP-1α、RANTES、CCL9和IP-10在NZB/NZWF1狼瘡鼠腎組織中的表達(dá)。構(gòu)建過表達(dá)musIFIT1的小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞，RealtimePCR檢測(cè)musIFIT1對(duì)小鼠單核巨噬細(xì)胞LPS刺激下上述趨化

6、因子表達(dá)的影響。 結(jié)果： 1.通過電轉(zhuǎn)染及慢病毒shRNA干擾技術(shù)在Jurkat淋巴細(xì)胞系中建立了較為穩(wěn)定的IFIT1過表達(dá)及基因沉默體系，發(fā)現(xiàn)IFIT1上調(diào)了活化的淋巴細(xì)胞趨化因子IL-8的mRNA及蛋白水平；同時(shí)應(yīng)用IFIT1shRNA重組慢病毒在THP-1細(xì)胞中顯著抑制IFIT1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)IFIT1基因沉默也能顯著下調(diào)單核巨噬細(xì)胞LPS刺激下IL-8的表達(dá)。 2.IL-8啟動(dòng)子區(qū)域含AP-1、NF-kB和

7、NFIL-6轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。熒光素酶報(bào)告基因顯示IFIT1通過上調(diào)AP-1實(shí)現(xiàn)對(duì)IL-8轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。EMSA結(jié)果提示IFIT1促進(jìn)活化的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子AP-1的DNA結(jié)合活性。Western-blot進(jìn)一步揭示IFIT1促進(jìn)AP-1上游p38的磷酸化。應(yīng)用特異性P38MAPK通路抑制劑SB203580能夠抑制IFIT1對(duì)活化的淋巴細(xì)胞工L-8的上調(diào)效應(yīng)。 3.IFIT1在SLE患者外周血白細(xì)胞表達(dá)較正常對(duì)照顯著增高，并與

8、SLEDAI積分及慢性損傷指數(shù)(SDI)正相關(guān)；IL-8表達(dá)水平與SDI積分正相關(guān)，且活動(dòng)性腎炎的SLE患者IL-8表達(dá)水平明顯增高。相關(guān)性分析顯示SLE患者外周血白細(xì)胞IFIT1與IL-8的表達(dá)具顯著正相關(guān)(r=0.6030，p=0.0003)。狼瘡腎炎患者腎小球和腎小管間質(zhì)區(qū)域IFIT1、IL-8及p-p38的表達(dá)均較正常腎組織明顯增強(qiáng)。 4.musIFIT1在NZB/NZWF1狼瘡鼠受累腎組織中顯著升高，同時(shí)伴隨趨化因子C