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文檔簡介
1、一.干細(xì)胞因子(stem cell factor,SCF)是一種多功能細(xì)胞因子,參與造血、哮喘、腫瘤增殖和血管新生等多種生理和病理活動。雖然低氧環(huán)境可以誘導(dǎo)SCF基因表達(dá),但具體的調(diào)節(jié)機(jī)制仍未闡明。低氧誘導(dǎo)因子-1(Hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)是參與低氧信號調(diào)節(jié)的重要轉(zhuǎn)錄因子。本研究旨在探討HIF-1是否參與低氧誘導(dǎo)的SCF基因表達(dá),以期闡明SCF在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。 方法:MCF-
2、7細(xì)胞置于低氧(1.5%O<,2>)和常氧(20%O<,2>)環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)。利用RNA干擾技術(shù)沉默HIF-1α基因在MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)。SCF mRNA和蛋白分別用實時定量PCR、蛋白印跡(WesteFrlblot)和酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)進(jìn)行檢測。染色體免疫共沉淀實驗(ChIP)用來檢測HIF-1與SCF基因啟動子在活細(xì)胞內(nèi)的結(jié)合情況。HIF-1α真核表達(dá)質(zhì)粒和SCF基因啟動子熒光素酶報告基因共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,SCF
3、基因轉(zhuǎn)錄情況應(yīng)用熒光素酶分析進(jìn)行檢測。應(yīng)用表皮生長因子(EGF)刺激HIF-1α和SCF在常氧條件下的表達(dá)。 結(jié)果:低氧在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)SCF基因表達(dá)。沉默HIF-1α基因顯著下調(diào)SCF mRNA和蛋白表達(dá)。分析SCF基因啟動子5’非編碼區(qū),發(fā)現(xiàn)存在經(jīng)典的低氧反應(yīng)元件(HRE;5’-GCGTG-3’),存在于距離轉(zhuǎn)錄起始點-68至-64個核苷酸區(qū)域。染色體免疫共沉淀分析發(fā)現(xiàn)HIF-lα在常氧條件下直接結(jié)合SCF的HRE區(qū)域,并且這
4、種結(jié)合效應(yīng)隨著低氧信號刺激而增強(qiáng)。過表達(dá)HIF-1α增強(qiáng)SCF啟動子在MCF-7和HEK293細(xì)胞中的表達(dá),突變HRE后這種增強(qiáng)效應(yīng)消火。我們也發(fā)現(xiàn)EGF可以在常氧條件下上調(diào)SCF基因表達(dá),并且這種上調(diào)作用依賴HIF-1α。 結(jié)論:SCF是一個新的受HIF-1α直接調(diào)控的靶基因。低氧和EGF信號共同存在于腫瘤微環(huán)境中,二者協(xié)同作用,通過HIF-1α上調(diào)SCF和其他血管新生因子,促進(jìn)腫瘤組織血管新生。 二.慢性特發(fā)性血小板
5、減少性紫癜(chronic ITP)是抗血小板抗體介導(dǎo)的一種器官特異性自身免疫性疾病。瘦素是由脂肪細(xì)胞分泌的多功能細(xì)胞因子,最近研究表明,瘦素參與多種自身免疫性疾病的發(fā)生過程。本研究旨在探討瘦素在該疾病發(fā)病過程中的免疫學(xué)行為。 方法:ELISA法檢測慢性ITP患者血漿中的瘦素及其可溶性受體的表達(dá);實時熒光定量PCR檢測慢性ITP患者外周血單個核細(xì)胞長型瘦素受體(Ob-Rb)mRNA的表達(dá);重組瘦素刺激體外培養(yǎng)慢性ITP患者來源的
6、脾及外周血單個核細(xì)胞,競爭性ELISA法評價不同劑量瘦素對IgG抗血小板抗體產(chǎn)生的作用;利用磁珠分選法從脾細(xì)胞中分選出CD4<'+>T細(xì)胞,比較去除CD4<'+>T細(xì)胞前后,瘦素刺激的IgG抗血小板抗體產(chǎn)生是否存在差異。有限稀釋法測定瘦素刺激前后血小板反應(yīng)性T細(xì)胞群數(shù)量的差異。 結(jié)果:慢性ITP 患者中血漿瘦素水平(中位數(shù):29.4ng/ml)顯著高于正常對照組(中位數(shù):2.2ng/ml,p<0.001),血漿可溶性瘦素受體水平
7、(中位數(shù):15.5ng/m1)顯著低于正常對照組(中位數(shù):21.9ng/ml,p=0.03)。實時定量PCR測定慢性ITP患者來源的外周血單個核細(xì)胞瘦素長型受體mRNA較正常對照組增高約2.1倍,(P=0.03)。體外施加重組瘦素或者慢性ITP患者來源的高瘦素血清,可以誘導(dǎo)慢性,ITP患者脾及外周血單個核細(xì)胞產(chǎn)生1gG抗血小板抗體增加。從脾細(xì)胞中去除CD4<'+>T細(xì)胞后,瘦素不能誘導(dǎo)IgG抗血小板抗體的產(chǎn)生。有限稀釋法測定,經(jīng)瘦素刺激
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