ROG負(fù)向調(diào)控T淋巴細(xì)胞因子表達(dá)機(jī)制的研究.pdf

1、哮喘發(fā)病的核心機(jī)制是Th1/Th2細(xì)胞因子比例的降低,而Th1細(xì)胞因子與Th2細(xì)胞因子之間存在交互抑制作用,故抑制對(duì)Th2細(xì)胞因子表達(dá)具有促進(jìn)作用的轉(zhuǎn)錄因子GATA-3,或刺激對(duì)Th1細(xì)胞因子表達(dá)具有促進(jìn)作用的轉(zhuǎn)錄因子T-bet,被認(rèn)為是糾正哮喘T淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞)因子失衡的有效途徑。前期研究發(fā)現(xiàn)了-個(gè)可抑制GATA-3功能的轉(zhuǎn)錄因子ROG(Repressor of GATA-3),在其高表達(dá)的CD4+T細(xì)胞,Th1細(xì)胞因子和Th2細(xì)胞

2、因子的表達(dá)均受到抑制,但機(jī)制不明。闡明ROG負(fù)向調(diào)控T細(xì)胞因子表達(dá)的確切機(jī)制,對(duì)于明確哮喘T細(xì)胞因子失衡機(jī)理,具有重要意義。 ROG是一種淋巴細(xì)胞特異性基因,所表達(dá)的蛋白是抑制性鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族的一個(gè)新成員。初期研究發(fā)現(xiàn),在初始CD4+T細(xì)胞受到抗CD3刺激后的早期,ROG即可迅速表達(dá),并可明顯抑制GATA-3誘導(dǎo)的反式激活,完全抑制GATA-3對(duì)IL-4和IL-5啟動(dòng)子的激活,因此命名為GATA-3抑制因子；深入研究發(fā)現(xiàn),在對(duì)

3、CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)染ROG基因后,Th1、Th2細(xì)胞因子的表達(dá)量均明顯下降。ROG抑制Th2細(xì)胞因子的表達(dá)可能是部分或者完全通過其對(duì)GATA-3的抑制所實(shí)現(xiàn),但其抑制Th1細(xì)胞因子的途徑,尚不得而知。除GATA-3外,ROG的下游應(yīng)該另有負(fù)向調(diào)控T細(xì)胞因子表達(dá)的靶點(diǎn)。 基于目前對(duì)T細(xì)胞因子表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展,ROG調(diào)控T細(xì)胞因子表達(dá)的可能靶點(diǎn)包括:T細(xì)胞膜上的CD3分子(T細(xì)胞胞膜第一信號(hào))、T細(xì)胞膜上的共刺激信號(hào)分子如CD2

4、8、可誘導(dǎo)T細(xì)胞共刺激分子(Inducible T cellcostimulator,ICOS)、細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4(Cytotoxic T-LymphocyteAntigen 4,CTLA-4)等(T細(xì)胞胞膜第二信號(hào))、胞漿內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分子CD45等(T細(xì)胞胞漿內(nèi)信號(hào))。在對(duì)這些信號(hào)分子的特點(diǎn)進(jìn)行分析后,我們提出以下假設(shè):ROG是通過直接或間接抑制CD3、CD28、ICOS等對(duì)T細(xì)胞因子表達(dá)具有刺激作用的分子,或通過間接刺

5、激CTLA-4、CD45等對(duì)T細(xì)胞因子表達(dá)具有抑制作用的分子,從而抑制T細(xì)胞因子的表達(dá)。 為了驗(yàn)證以上假設(shè),并揭示相關(guān)的機(jī)制,我們?cè)O(shè)計(jì)了以下研究方案：首先,以熒光定量PCR和Western Blot分別了解初始狀態(tài)的Th1、Th2細(xì)胞中ROG及CD3、CD28、ICOS、CTLA-4、CD45在基因水平和蛋白水平的基礎(chǔ)表達(dá)狀況,并以ELISA分別檢測(cè)Th1、Th2細(xì)胞培養(yǎng)液中IFN-γ、IL-4的表達(dá)狀況；其次,以ROG-pcD

6、NA3.1分別轉(zhuǎn)染Th1、Th2細(xì)胞,誘導(dǎo)Th1、Th2細(xì)胞中的ROG表達(dá)上調(diào),分別采用熒光定量PCR和Western Blot方法觀察Th1、Th2細(xì)胞中CD3、CD28、ICOS、CTLA-4、CD45在基因水平和蛋白水平的表達(dá)變化情況,并以ELISA分別檢測(cè)Th1、Th2細(xì)胞培養(yǎng)液中IFN-γ、IL-4的表達(dá)狀況；最后,以ROG-siRNA分別轉(zhuǎn)染Th1、Th2細(xì)胞,誘導(dǎo)Th1、Th2細(xì)胞中的ROG表達(dá)下調(diào),分別采用熒光定量PCR

7、和Western Blot方法觀察Th1、Th2細(xì)胞中CD3、CD28、ICOS、CTLA-4、CD45在基因水平和蛋白水平的表達(dá)變化情況,并以ELISA分別檢測(cè)Th1、Th2細(xì)胞培養(yǎng)液中IFN-γ、IL-4的表達(dá)狀況。 結(jié)果顯示,在初始狀態(tài)的Th1、Th2細(xì)胞中,ROG的表達(dá)水平較低(P<0.01)。與初始狀態(tài)的Th1、Th2細(xì)胞相比,經(jīng)ROG基因轉(zhuǎn)染的Th1、Th2細(xì)胞中,ROG的表達(dá)量顯著升高(P<0.01),伴隨ICOS

8、的表達(dá)量顯著降低(P<0.01),而CD3、CD28、CTLA-4、CD45的表達(dá)狀況無顯著性改變(P>0.05);與初始Th1細(xì)胞的培養(yǎng)液相比,經(jīng)ROG基因轉(zhuǎn)染的Th1細(xì)胞的培養(yǎng)液中,IFN-γ的表達(dá)量顯著降低(P<0.01),而與初始Th2細(xì)胞的培養(yǎng)液相比,經(jīng)ROG基因轉(zhuǎn)染的Th2細(xì)胞的培養(yǎng)液中,IL-4的表達(dá)量顯著降低(P<0.01)。與初始狀態(tài)的Th1、Th2細(xì)胞相比,經(jīng)ROG基因表達(dá)沉默的Th1、Th2細(xì)胞中,ROG的表達(dá)量顯

9、著降低(P<0.01),伴隨ICOS的表達(dá)量顯著升高(P<0.01),而CD3、CD28、CTLA-4、CD45的表達(dá)狀況無顯著性改變(P>0.05);與初始Th1細(xì)胞的培養(yǎng)液相比,經(jīng)ROG基因表達(dá)沉默的Th1細(xì)胞的培養(yǎng)液中,IFN-γ的表達(dá)量顯著升高(P<0.01),而與初始Th2細(xì)胞的培養(yǎng)液相比,經(jīng)ROG基因表達(dá)沉默的Th2細(xì)胞的培養(yǎng)液中,IL-4的表達(dá)量顯著升高(P<0.01)。 由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,ROG表達(dá)上調(diào)可通過抑

10、制ICOS表達(dá)而抑制T細(xì)胞因子表達(dá),ROG表達(dá)下調(diào)可通過促進(jìn)ICOS表達(dá)而促進(jìn)T細(xì)胞因子表達(dá),即ROG可通過負(fù)調(diào)控ICOS的表達(dá)而負(fù)調(diào)控T細(xì)胞因子的表達(dá)。通過生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn),在ICOS的啟動(dòng)子區(qū)包含有GATA-1區(qū),而后者與GATA-3具有76％的同源性,且GATA-1和GATA-3都是對(duì)基因轉(zhuǎn)錄具有重要啟動(dòng)作用的轉(zhuǎn)錄因子,因此,推測(cè)ROG對(duì)ICOS表達(dá)的抑制作用是通過其對(duì)GATA-1的抑制作用而間接導(dǎo)致。 本研究豐富了RO