ATP敏感性鉀通道和帕金森病的相關性研究.pdf

1、在已有的學術基礎上，我們提出KATP和PD的發(fā)生、發(fā)展存在相關性的科學問題，本文的研究工作旨在闡明KATP在PD發(fā)病機制中的地位和作用，探討KATP作為PD藥物研發(fā)靶標的可能性。同時，我們應用我國學者設計、合成的新型KATP開放劑埃他卡林(iptakalim，IPT)在PD動物模型上開展實驗治療學研究，從實驗治療學的角度佐證KATP與PD相關的學術觀點。前期的研究發(fā)現(xiàn)IPT不僅可以透過血腦屏障，而且在不擴張血管和降低血壓的劑量時，即可對

2、急性腦缺血損傷產(chǎn)生確切的神經(jīng)保護作用，使得在整體動物模型通過系統(tǒng)給藥評價KATP開放劑(KATPchannelopener，KCO)對PD的實驗治療作用成為可能。 本文工作第一部分應用學術界公認的6-羥基多巴(6-hydroxydopamine，6-OHDA)制備的PD模型大鼠，研究KATP在PD模型大鼠相關腦區(qū)的表達變化，闡明KATP與PD發(fā)生、發(fā)展的相關性；第二部分分別應用氟哌啶醇(haloperidol)、6-OHDA建立

3、PD大鼠模型，評價KCO對PD模型大鼠的實驗治療學作用，探討IPT的神經(jīng)保護作用及其可能機制，從實驗治療學的角度佐證KATP與PD相關的學術觀點，為將IPT發(fā)展成為PD治療新藥積累必要的學術與實驗基礎。 第一部分KATP在6-OHDA制備的PD模型大鼠相關腦區(qū)的表達變化 目的：研究6-OHDA制備的PD模型大鼠皮層、海馬及紋狀體KATP表達變化，闡明KATP和PD發(fā)生、發(fā)展的相關性。 方法：1)6-OHDA制備P

4、D模型大鼠：SD大鼠右側黑質立體定位注射6-OHDA8μg·μL-1，另取數(shù)只大鼠僅注射溶劑，作為偽手術組。大鼠飼養(yǎng)21天后，頸部皮下給予apomorphine(0.05mg·kg-1)誘導旋轉行為，記錄30min，大于7圈/分的大鼠在7天后繼續(xù)重復篩選，兩次均符合標準的大鼠即為成功的PD大鼠模型；2)KATP各亞基mRNA轉錄變化：處死PD模型大鼠，快速冰上取腦，分離皮層、海馬及紋狀體，提取mRNA進行RT-PCR實驗，觀察PD模型大

5、鼠皮層、海馬及紋狀體KATP各種亞基的mRNA轉錄水平的改變；3)KATP各亞基蛋白表達變化：灌注PD模型大鼠，取腦制作蠟塊，分別切取皮層、紋狀體和海馬的石蠟切片，利用特異性的KATP抗體進行免疫組織化學實驗，觀察PD模型大鼠皮層、海馬及紋狀體KATP蛋白表達的改變。 結果：1)RT-PCR實驗結果表明：PD模型大鼠患側皮層的Kir6.2和SUR2mRNA水平、患側海馬的Kir6.1和Kir6.2mRNA水平、患側紋狀體的Kir

6、6.1、Kir6.2和SUR1mRNA水平較健側及偽手術組均顯著升高。2)免疫組織化學實驗結果表明：PD模型大鼠患側皮層的Kir6.2和SUR2蛋白表達水平、患側海馬的Kir6.1和Kir6.2蛋白表達水平、患側紋狀體的Kir6.1、Kir6.2和SUR1蛋白表達水平較健側及偽手術組均顯著升高。 結論：PD模型大鼠患側相關腦區(qū)的KATP某些亞基較健側表達顯著上調(diào)，表明KATP可能與PD的發(fā)生、發(fā)展相關。 第二部分新型KA

7、TP開放劑埃他卡林對PD模型大鼠實驗治療學研究 一、埃他卡林對haloperidol建立的PD模型大鼠的實驗治療作用目的：研究新型KATP開放劑IPT對haloperidol誘導的大鼠帕金森樣癥狀的實驗治療作用，初步探討IPT作為PD治療藥物的可能性。 方法：1)應用haloperidol建立PD行為學模型：大鼠皮下給予haloperidol0.225mg·kg-1，用于研究IPT對catalepsy癥狀的改善作用；大鼠

8、皮下給予haloperidol0.1mg·kg-1，用于研究IPT對hypolocomotion改善作用，包括walkingtime、rearingandgrooming；2)動物分組如下：空白對照組(給予相應體積的溶劑)，，haloperidol，haloperidol+L-DOPA(100mg·kg-1，ip)，haloperidol+IPT(0.025mg·kg-1，iv)，haloperidol+IPT(0.05mg·kg-1，

9、iv)，haloperidol+IPT(0.125mg·kg-1，iv)，haloperidol+IPT(0.25mg·kg-1，iv)，haloperidol+IPT(0.5mg·kg-1，iv)，haloperidol+IPT(0.25mg·kg-1，iv)+L-DOPA(100mg·kg-1，ip)。在大鼠皮下注射haloperidol30min后，分別給予各組大鼠相應藥物，通過計算大鼠前爪運動潛伏時間、行走時間、直立及梳洗次數(shù)，

10、觀察IPT對大鼠全身僵硬癥狀和自發(fā)性活動的影響。 結果：1)Catalepsy實驗表明，在給予治療藥物30、60min后，IPT0.125、0.25、0.5mg·kg-1可以改善haloperidol誘導的大鼠全身僵硬癥狀。2)Walkingtime實驗表明，在給予治療藥物30、60min后，IPT0.125、0.25、0.5mg·kg-1在30、60min后，均可增加haloperidol誘導的大鼠自發(fā)性活動次數(shù)的減少癥狀。3

11、)Rearingandgrooming實驗表明，在給予治療藥物30min后，IPT0.125、0.25、0.5mg·kg-1可緩解haloperidol誘導的大鼠的直立和梳洗次數(shù)減少癥狀。 結論：IPT緩解haloperidol引起的大鼠全身僵硬和自發(fā)性活動的減少，對PD行為學模型大鼠的帕金森樣癥狀有顯著的改善作用。 二、埃他卡林對6-OHDA制備的PD模型大鼠的實驗治療作用 目的：研究IPT對6-OHDA制備的

12、PD模型大鼠實驗治療學作用及相關機制。 方法：1)6-OHDA制備PD模型大鼠：SD大鼠右側黑質立體定位注射6-OHDA8μg·μL-1，另取數(shù)只大鼠僅注射溶劑，作為偽手術組。飼養(yǎng)21天后，頸部皮下給予apomorphine(0.05mg·kg-1)誘導旋轉行為，篩選成功的PD大鼠模型；2)成功PD模型大鼠分為5組進行給藥治療：IPT治療組(0.75mg·kg-1·day-1，1.5mg·kg-1·day-1，3.0mg·kg-

13、1·day-1)，L-DOPA治療組(10mg·kg-1·day-1)，均每天灌胃給藥一次，持續(xù)21天；模型組、偽手術組大鼠均每天灌胃相應體積生理鹽水，持續(xù)21天；3)在給藥治療第7、14及21天，各組大鼠均進行apomorphine誘導的旋轉實驗，進行行為學檢測；4)第二周治療結束時，各組大鼠進行立體定位手術在大鼠雙側紋狀體埋置套管，術后恢復6天，相應行為學測試后，進行微透析實驗，收集生物樣品，HPLC檢測微透析液中的神經(jīng)遞質水平；5

14、)微透析實驗結束后，灌注大鼠，制備黑質冰凍切片，應用免疫組織化學法研究黑質腦區(qū)DA神經(jīng)元及星形膠質細胞數(shù)量的變化；6)原代培養(yǎng)大鼠星形膠質細胞，進行[3H]-D,L-Glu再攝取實驗研究IPT對6-OHDA誘導的原代星形膠質細胞GluTs功能改變的影響。 結果：1)L-DOPA10mg·kg-1·day-1，IPT3.0mg·kg-1·day-1在治療三周內(nèi)均顯著改善6-OHDAPD模型大鼠的apomorphine誘導的旋轉行為

15、。2)IPT(1.5mg·kg-1·day-1，3.0mg·kg-1·day-1)在降低健側紋狀體細胞外DA水平的同時，能夠增加患側紋狀體DA水平；L-DOPA和IPT(O.75mg·kg-1·day-1，1.5mg·kg-1·day-1，3.0mg·kg-1·day-1)對PD模型大鼠健側紋狀體細胞外Glu水平?jīng)]有影響，但是均可以顯著降低患側紋狀體的細胞外Glu水平。3)模型組大鼠毀損側SN的TH陽性細胞數(shù)較健側及偽手術組大鼠顯著減少

16、，IPT治療組大鼠的毀損側、健側與模型組大鼠黑質TH陽性細胞計數(shù)沒有顯著性差異；模型組大鼠毀損側SN的GFAP陽性細胞數(shù)較健側及偽手術組大鼠顯著增加，IPT治療組大鼠毀損側較模型組GFAP陽性細胞數(shù)顯著減少，而治療組大鼠健側的GFAP陽性細胞數(shù)較模型組及偽手術組大鼠健側沒有顯著改變。4)6-OHDA50μmol·L-1顯著抑制星形膠質細胞谷氨酸攝取功能，IPT1μmol·L-1，10μmol·L-1及pinacidil10μmol·L-

17、1均能夠逆轉6-OHDA對星形膠質細胞谷氨酸攝取功能的抑制作用，glibenclamide能夠阻斷IPT及pinacidil的作用。 結論：IPT顯著改善6-OHDA所致PD模型大鼠的行為障礙；IPT通過對星形膠質細胞功能的調(diào)節(jié)包括抑制星形膠質細胞活化、增強星形膠質細胞谷氨酸轉運體的功能而實現(xiàn)對黑質-紋狀體通路中神經(jīng)遞質水平的雙向調(diào)節(jié)作用，進而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。 綜上所述，本文工作的主要創(chuàng)新之處在于1.提出KATP和PD