ATP-敏感性鉀通道的表達(dá)水平與緩激肽誘導(dǎo)的血腫瘤屏障開放相關(guān)關(guān)系的研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)較常見的一種惡性腫瘤疾病，術(shù)后化療是治療該病的一個(gè)重要手段。然而腫瘤組織的毛細(xì)血管存在血腫瘤屏障(blood-tumorbarrier，BTB)，限制了大分子量的化療藥物進(jìn)入腫瘤組織，因此極大地影響了該病術(shù)后化療的效果。要有效地增加腫瘤組織內(nèi)抗腫瘤藥物的濃度，同時(shí)又要減少治療藥物對(duì)正常腦組織的影響，即選擇性開放血腫瘤屏障成為有效治療腦膠質(zhì)瘤病的關(guān)鍵。近年來許多研究者進(jìn)行了血管活性物質(zhì)選擇性開放BTB的研究工作，目前較有

2、效且相對(duì)安全可控的血管活性物質(zhì)是緩激肽(Bradykinin，BK)和其類似物RMP-7。然而經(jīng)研究者將RMP-7用于臨床前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雖然RMP-7與卡鉑結(jié)合使用可有效的治療腦膠質(zhì)瘤，但是給具有相同診斷的腦膠質(zhì)瘤病人RMP-7時(shí)，反映血腦屏障通透性指標(biāo)的Ki值差異極大。這意味著如果在臨床中運(yùn)用該藥選擇性開放腦腫瘤組織部位的BTB很可能存在極大的療效差異，因此RMP-7并未在臨床得以廣泛應(yīng)用。 我們推測(cè)這種差異的存在與小劑量緩激

3、肽選擇性開放血腫瘤屏障的機(jī)理密切相關(guān)。該機(jī)理可能涉及：緩激肽與其B2受體特異性結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+增多，促使胞內(nèi)NO及cGMP濃度的增加，使腫瘤毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)小泡增多，進(jìn)而增加血腫瘤屏障的通透性。是否有其他途徑或其它因素參與尚待研究。近來有報(bào)道，ATP-敏感性鉀通道(ATP-sensitivepotassiumchannel，KATPchannel)表達(dá)在腫瘤毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上，可以促進(jìn)血腫瘤屏障的通透性增加。我們推測(cè)該通道

4、可能是緩激肽選擇性開放血腫瘤屏障機(jī)理中的下位靶點(diǎn)之一。 本研究首先建立大鼠腦膠質(zhì)瘤模型，在該模型上測(cè)定頸動(dòng)脈灌注小劑量緩激肽后腫瘤組織KATP通道的表達(dá)水平，并且觀察該通道在腫瘤細(xì)胞和腫瘤毛細(xì)血管上表達(dá)分布的變化；進(jìn)而在培養(yǎng)的C6腫瘤細(xì)胞上，測(cè)定緩激肽和KATP通道的調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)通道電流和膜電位的影響。綜合分析KATP通道的表達(dá)水平與緩激肽灌注引起血腦屏障通透性改變之間的關(guān)系，試圖為證實(shí)KATP通道是緩激肽選擇性開放血腫瘤屏障機(jī)制

5、的下位靶點(diǎn)之一提供理論依據(jù)，深化緩激肽選擇性開放血腦屏障機(jī)制的研究，同時(shí)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供新靶點(diǎn)和新途徑。 材料和方法一、實(shí)驗(yàn)材料1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本研究采用中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的Wistar大鼠72只，均為雌性，體重在180～200g，所有的實(shí)驗(yàn)操作過程完全符合NIH所規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。 2.實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株本研究采用大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞株由日本山梨醫(yī)科大學(xué)腦神經(jīng)外科教研室惠贈(zèng)。 3.主要試劑兔抗大鼠KATP通道

6、Kir6.2亞基多克隆抗體、小鼠抗人血管內(nèi)皮第八因子單克隆抗體均購(gòu)于美國(guó)SantaCruzBiotechnology公司；緩激肽(Bradykinin，BK)、ECL(enhancedchemiluminescence)試劑盒、FITC標(biāo)記的山羊抗兔二次抗體、CY3標(biāo)記的山羊抗小鼠二次抗體、MinoxidilSulfate(MS)和Glibenclamide均購(gòu)于美國(guó)SigmaChemical公司；辣根過氧化物酶結(jié)合羊抗兔免疫球蛋白和S

7、ABC法免疫組化試劑盒均購(gòu)于北京中山公司；K2ATP購(gòu)于美國(guó)SigmaChemical公司。 4.主要儀器二氧化碳培養(yǎng)箱；超凈工作臺(tái)；大鼠腦立體定向儀；低溫冷凍離心機(jī)；紫外分光光度計(jì)；自動(dòng)電泳凝膠成像系統(tǒng)；通用電泳儀；正置熒光顯微鏡；-80℃深低溫冰箱；恒溫冷凍切片機(jī)；MoticImagesAdvanced3.2圖像分析系統(tǒng)。垂直電極拉制器；Axopatch-1D膜片鉗放大器；雙軌記憶示波器(VC-10)；AD/DA轉(zhuǎn)換板和計(jì)算

8、機(jī)支持的pCLAMP5.5.1程序。 二、實(shí)驗(yàn)方法1.建立大鼠C6腦膠質(zhì)瘤模型。 2.用H&E(HematoxylinandEosin)染色法確定腫瘤種植的具體位置及病理分級(jí)。 3.經(jīng)大鼠膠質(zhì)瘤側(cè)頸動(dòng)脈灌注小劑量緩激肽，運(yùn)用Westernblot法測(cè)·2·定緩激肽灌注不同時(shí)間點(diǎn)(0，5，10，15，30min)腫瘤部位KATP通道蛋白的表達(dá)水平變化。再分別灌注KATP通道開放劑MS，以及緩激肽和該通道抑制劑Gli

9、benclamide的混合物，測(cè)定所誘導(dǎo)產(chǎn)生的KATP通道蛋白水平變化作為對(duì)照。 4.根據(jù)H&E染色的結(jié)果用免疫組化SABC染色法觀察給予小劑量緩激肽灌注前后KATP通道的表達(dá)水平變化以及分布部位的改變。 5.雙重免疫組化熒光染色和正置熒光顯微鏡觀察KATP通道在給予小劑量緩激肽灌注前后在腫瘤組織及腫瘤毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)情況。 6.運(yùn)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)測(cè)定小劑量緩激肽和KATP通道的調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)通道電流和膜電

10、位的影響。 7.圖像分析Westernblot結(jié)果用ChemiImager5500V2.03軟件進(jìn)行掃描，用FluorChen2.0軟件進(jìn)行定量分析測(cè)得IDV值。免疫組化染色結(jié)果用MoticImagesAdvanced3.2實(shí)時(shí)圖像分析系統(tǒng)采集照片并進(jìn)行半定量分析。雙重免疫組化熒光染色結(jié)果用SPOTAdvanced4.0.2軟件采集照片進(jìn)行分析。 8.統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS(statisticalpackageforthe

11、socialscience)統(tǒng)計(jì)分析處理軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(standarddeviation，SD)表示。Westernblot結(jié)果用單因素方差分析(ANOVA)法分析組間差異，Dunnett'sposthoc檢驗(yàn)法分析特異性組間差異。免疫組化染色結(jié)果和全細(xì)胞膜片鉗結(jié)果用配對(duì)Student'st檢驗(yàn)法分析。P＜0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論:1.本研究首次證明了緩激肽以時(shí)間相關(guān)的方式誘導(dǎo)腫瘤