人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞移植治療角膜內(nèi)皮衰竭的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：角膜內(nèi)皮疾病如大泡性角膜病變、Fuchs角膜內(nèi)皮營養(yǎng)不良、內(nèi)眼手術(shù)后內(nèi)皮失代償?shù)仁菍?dǎo)致角膜混濁和視力下降的重要原因。每年全世界約有100萬以上的患者因?yàn)榻悄?nèi)皮功能失代償而導(dǎo)致失明，目前唯一有效的治療方法是穿透性角膜移植術(shù)。雖然該術(shù)式成功率較高，但由于供體角膜缺乏、術(shù)后排斥反應(yīng)、角膜供體老齡化等原因而受到限制。組織工程化角膜是當(dāng)今眼科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，而亟待解決關(guān)鍵問題之一是如何構(gòu)建角膜內(nèi)皮組織。人們嘗試多種方法培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞，但

2、因受到供體角膜缺乏，載體穩(wěn)定性差，手術(shù)操作中易破碎等因素限制，至今仍無法應(yīng)用于臨床。為尋求一種不依賴于供體角膜而構(gòu)建角膜內(nèi)皮組織的有效方法，本實(shí)驗(yàn)首次取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical veinendothelial cell，HUVEC)進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增，代替有限的角膜內(nèi)皮細(xì)胞，并以異種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)為載體進(jìn)行后板層角膜移植(Posterior lamellarendothelial keratoplasty，PLEK

3、)治療機(jī)械性損傷所致的兔角膜內(nèi)皮衰竭，通過與單純脫細(xì)胞角膜基質(zhì)移植及單純?nèi)コ齼?nèi)皮進(jìn)行對比，探討異種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞移植治療角膜內(nèi)皮衰竭的可行性。 方法：1．動(dòng)物模型：30只新西蘭白兔(2.5～3kg)，麻醉后沿左眼角膜緣切開270°，顯微鏡下全角膜范圍去除角膜內(nèi)皮細(xì)胞，建立機(jī)械損傷所致的內(nèi)皮衰竭動(dòng)物模型。將動(dòng)物模型隨機(jī)分為3組，實(shí)驗(yàn)組、基質(zhì)組和對照組，每組10只動(dòng)物，4周后實(shí)驗(yàn)組和基質(zhì)組行后板層角膜移植術(shù)。2．

4、載體制備：取豬角膜全層，制成直徑為7.5 mm、厚約0.1mm板層角膜片，以Triton-胰蛋白酶聯(lián)合方法進(jìn)行脫細(xì)胞處理，對脫細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)行HE染色，觀察細(xì)胞是否去除完全。3．細(xì)胞培養(yǎng)：采用0.1﹪膠原酶Ⅰ灌流消化法獲取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，用含有20﹪胎牛血清和10ng/ml VEGF的DMEM/F12(1:1)培養(yǎng)基進(jìn)行原代培養(yǎng)5～7天，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80﹪～90﹪融合生長時(shí)進(jìn)行消化傳代。將第二代細(xì)胞以2×10<'6>個(gè)/cm<'2>密度接種

5、于制備好的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)上繼續(xù)培養(yǎng)，倒置顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，一周時(shí)細(xì)胞在脫細(xì)胞角膜基質(zhì)上生長成完整單層后用于移植。4．移植手術(shù)：做直徑為9 mm、3/4角膜厚度的帶蒂前層角膜瓣并掀置一側(cè)，再用直徑7.25 mm的環(huán)鉆鉆去中央后部1/4層角膜，形成植床，將植片置于植床，8-0可吸收線間斷縫合，10-0尼龍線：間斷縫合前層角膜瓣，術(shù)后觀察3個(gè)月。結(jié)果：培養(yǎng)皿中及脫細(xì)胞角膜基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞均在24小時(shí)完成貼壁，開始為短梭形或多角形，一周時(shí)形

6、成單層，細(xì)胞呈“鋪路石樣”外觀，大小一致，排列緊密。脫細(xì)胞角膜基質(zhì)為半透明薄片，組織學(xué)觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)完全消失，纖維支架保存良好，排列疏松。術(shù)后3個(gè)月時(shí)，實(shí)驗(yàn)組兔角膜水腫程度較基質(zhì)組和對照組明顯減輕，透明度增加，內(nèi)皮細(xì)胞密度為(2026.4±129.3)個(gè)/mm<'2>，中央角膜厚度平均為(505.2±25.4)μm，基質(zhì)組中央角膜厚度平均為(1535.6±114.5)μm，而對照組為(1493.5±70.2)μm。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成