受體骨髓干細(xì)胞在大鼠移植肝內(nèi)向血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化.pdf

1、背景：1963年，Starzl成功施行了世界第一例臨床原位肝移植(Orthotopiclivertransplantation，OLT)。幾十年來，通過在器官保存、手術(shù)技術(shù)、抗排斥藥物、術(shù)前術(shù)后處理等領(lǐng)域的重大進(jìn)展，肝移植成為公認(rèn)治療終末期肝病的外科手段。移植術(shù)后的排斥反應(yīng)仍然是威脅患者和移植物長(zhǎng)期存活的主要原因。移植排斥反應(yīng)的本質(zhì)上是由于供體作為異基因抗原侵入引起受體特異性免疫激活而造成對(duì)供體組織結(jié)構(gòu)和功能持續(xù)損傷的病理過程。我們?cè)O(shè)想

2、，移植的肝臟如果能夠被特異性的受體細(xì)胞替代，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榕c受體基因類似或相同的器官，移植的肝臟就不會(huì)被排斥而長(zhǎng)期存活。 骨髓來源的干細(xì)胞主要包括造血干細(xì)胞(hematopoieticstemcells，HSCs)、間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcellls，MSCs)和多能成體祖細(xì)胞(multipotentadultprogenitorcells，MAPCs)等。具有多向分化潛能的骨髓干細(xì)胞具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。近

3、期干細(xì)胞研究的進(jìn)展證實(shí)，人類和嚙齒類動(dòng)物的骨髓源干細(xì)胞可分化為多種細(xì)胞類型，包括骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等。自身成體骨髓干細(xì)胞可避免免疫排斥反應(yīng)。在肝移植術(shù)后，受體特異性骨髓干細(xì)胞能不能回輸?shù)揭浦哺沃?，?shí)現(xiàn)向受體自身肝組織細(xì)胞的分化，從而實(shí)現(xiàn)供肝的“受體化”，從而實(shí)現(xiàn)減輕排斥反應(yīng)，改善肝臟功能呢? 我們先期進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中將與雌性受體大鼠同一品系的雄性大鼠骨髓源干細(xì)胞經(jīng)門脈同期輸入來源于不同種系雌性大鼠的

4、供肝，實(shí)驗(yàn)組的中位生存時(shí)間，肝臟功能明顯優(yōu)于對(duì)照組。在停用亞治療劑量的免疫抑制劑后實(shí)驗(yàn)組大鼠長(zhǎng)期存活，后期病理檢查未見明顯排斥反應(yīng)。成功誘導(dǎo)了免疫耐受狀態(tài)的出現(xiàn)。我們發(fā)現(xiàn)移植的骨髓干細(xì)胞向肝樣細(xì)胞橫向分化，移植細(xì)胞的替代率60天可達(dá)(62.70±1.79)％；甲胎蛋白、白蛋白免疫組化雙陽性移植細(xì)胞百分率分別為(55.53±2.32)％，(56.83±2.32)％。初步證明了受體骨髓源干細(xì)胞能夠在移植肝臟內(nèi)生長(zhǎng)分化、發(fā)生替代。在前期實(shí)驗(yàn)中

5、總的移植細(xì)胞替代率要高于甲胎蛋白、白蛋白免疫組化雙陽性移植細(xì)胞百分率。提示除了向肝樣細(xì)胞分化以外可能同時(shí)發(fā)生了向其他組織細(xì)胞的分化。同時(shí)在常規(guī)病理切片中可見匯管區(qū)明顯的血管增生，是否出現(xiàn)了向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化呢? 骨髓中存在內(nèi)皮祖細(xì)胞，是一種能夠分化為血管內(nèi)皮的前體細(xì)胞，其可以由骨髓動(dòng)員到外周血，分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞，并整合到血管損傷部位，參與血管的修復(fù)。Gohra等曾經(jīng)深入觀察了同種腹主動(dòng)脈移植后其內(nèi)皮變化情況，他發(fā)現(xiàn)移植的腹主

6、動(dòng)脈由于缺血和再灌注損傷其內(nèi)皮部分缺損，移植后供者內(nèi)皮首先出現(xiàn)增殖，由于同種的排斥反應(yīng)，移植血管自身內(nèi)皮又逐漸脫落，最終受者內(nèi)皮增殖并覆蓋移植血管腔表面。在肝移植中同樣存在缺血再灌注損傷和免疫排斥反應(yīng)對(duì)于血管內(nèi)皮的損傷。因?yàn)檠軆?nèi)皮細(xì)胞是血液與組織間的重要屏障，是器官移植后供、受者細(xì)胞間最早接觸的場(chǎng)所，最早被免疫系統(tǒng)識(shí)別。血管內(nèi)皮細(xì)胞具備獨(dú)特的生物學(xué)功能：有免疫原性，有抗原提呈功能，其同白細(xì)胞相互作用在移植排斥反應(yīng)中有重要作用。如果在此

7、條件下骨髓源血管祖細(xì)胞早期參與血管內(nèi)皮的修復(fù)，受體來源血管內(nèi)皮細(xì)胞替代供肝組織內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞將對(duì)減輕排斥反應(yīng)改善供肝功能有著重要作用。 骨髓中的EPCs(血管內(nèi)皮祖細(xì)胞)表達(dá)CD34、CD133和VEGF-2，(鼠的對(duì)應(yīng)抗原稱fetalliverkinase-1，flk-1)而不表達(dá)VE-cadherin和vWF。EPCs釋放入血后CDl33標(biāo)志逐漸消失，CD34表達(dá)下調(diào)，并出現(xiàn)表達(dá)VE-cadherin、vWF、CD31、e

8、NOS等成熟血管內(nèi)皮標(biāo)志。CD133表達(dá)消失的同時(shí)出現(xiàn)vWF，可能為EPCs分化為成熟內(nèi)皮的標(biāo)志[11]。依據(jù)這些特點(diǎn)我們實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)擬建立雙袖套法大鼠原位肝移植模型，將受體特異性骨髓干細(xì)胞經(jīng)門靜脈途徑植入移植肝臟，觀察術(shù)后早期的病理表現(xiàn)，利用Sry原位雜交結(jié)合vWF免疫組化雙染觀察特異性骨髓干細(xì)胞是否可在肝內(nèi)轉(zhuǎn)化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，以期從中獲得提示和相關(guān)的證據(jù)。 目的：研究受體特異性骨髓干細(xì)胞在大鼠移植肝中向血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化情況及對(duì)

9、其大鼠原位肝臟移植早期排斥反應(yīng)的影響。 方法：用雙袖套法建立大鼠原位肝移植模型，供體為雌性Wistar大鼠，受體為雌性SD大鼠。受鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組6只，實(shí)驗(yàn)組12只。其中對(duì)照組僅行原位肝移植，實(shí)驗(yàn)組在原位肝移植術(shù)后關(guān)腹前經(jīng)門靜脈注射雄性SD大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞0.5ml(1×107個(gè)/ml)。受體大鼠均給予亞治療劑量的環(huán)孢素A(cyclosporineA，CsA)0.25mg/kg，肌注，1次/天，最長(zhǎng)維持14天。

10、術(shù)前一天開始。實(shí)驗(yàn)組再隨機(jī)分為3組，每組4只，分別在術(shù)后l周、2周、3周處死取材，觀察術(shù)后早期的病理變化；并對(duì)移植肝組織行雄性性別決定基因Sry原位雜交結(jié)合vWF免疫組化的雙標(biāo)技術(shù)，觀察受體特異性骨髓干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化情況。 結(jié)果：(1)手術(shù)后實(shí)驗(yàn)組一般情況明顯優(yōu)于對(duì)照組。(2)對(duì)照組術(shù)后存活時(shí)間7-12天，死亡后的常規(guī)病理表現(xiàn)為重度急性排斥反應(yīng)。(3)實(shí)驗(yàn)組在處死取材前一般狀況良好，術(shù)后早期的常規(guī)病理表現(xiàn)為輕到中度急性