大鼠肝部分切除術后肝竇內皮細胞PI3K-Akt信號傳導通路變化實驗研究.pdf

1、目的：本實驗分三個部分：1建立大鼠肝臟原位加體外循環(huán)膠原酶灌注、Percoll密度梯度離心法分離與培養(yǎng)肝竇內皮細胞，觀察Akt蛋白及NF-κB在肝切除術后肝竇內皮細胞中的表達。2觀察PI3K/Akt對肝竇內皮細胞分泌HGF、IL-6、NO和NOS等細胞因子功能的影響。3通過觀察PI3K/Akt對肝竇內皮細胞DNA合成及細胞周期的影響來探討它對肝部分切除術后可能通過啟動和促進肝竇內皮細胞各項功能，從而在肝再生發(fā)生中起到重要的作用。

2、 材料和方法 第一部分：Sprague-Dawley大鼠，雄性，體重在190-210g，平均體重200±3.5g，由第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實驗動物中心提供。CollagenaseⅣ、GBSS、購自美國Sigma公司，膠原酶S、膠原酶Ⅳ、DnaseⅠ、表皮生長因子(EGF，Cat.NO.1033476)。Percoll購自美國Pharmacia公司，CD14多抗(美國Santacruz)。CS-15高速冷凍離心機(美國Beckman

3、公司)。Akt單抗購自美國SantaCraz公司，LY294002購自美國Promega公司。采用Higgins&Aderson創(chuàng)建的經典大鼠肝部分切除術模型，即分別于肝左葉、中葉根部結扎切除。計算大鼠肝切除率，在術后0h、6h、24h、48h、72h五個不同的時相點，分離肝竇內皮細胞。HSEC分離方法采用肝臟原位勻速加離體循環(huán)膠原酶灌注、percoll密度梯度離心方法，得到HSEC沉淀，細胞計數，調整細胞濃度為(1.2-1.5)×10

4、6/ml，經37℃，5％CO2孵育20分鐘，待細胞選擇性貼壁后，收集未貼壁的細胞懸液，培養(yǎng)于24孔板(內置有膠原包被的蓋玻片)，孵箱培養(yǎng)5小時后更換培養(yǎng)液，此后每兩天換液一次。通過臺盼藍染色判斷測定細胞活性，CD14多抗免疫細胞化學染色及用掃描電鏡觀察超微結構鑒定HSEC。細胞培養(yǎng)24小時后，裂解細胞提取胞漿蛋白，作Westernblot觀察HSEC中Akt蛋白、磷酸化Akt及NF-κB的表達。 第二部分：實驗動物同第一部份，N

5、O和NOS檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；大鼠HGF和IL-6ELISAKIT購自美國TPI公司；百樂405型酶標儀；Phamacia分光光度計。采用Higgins&Aderson創(chuàng)建的經典大鼠肝部分切除術模型，即分別于肝左葉、中葉根部結扎切除。計算大鼠肝切除率，在術后0h、6h、24h、48h、72h五個不同的時相點，分離肝竇內皮細胞，分離方法同第一部份，HSEC細胞培養(yǎng)方法同第一部分；每時相點分為三組培養(yǎng)：SO組(假手術組)、

6、PH組(行肝部分切除組)、LY組(肝部分切除術后培養(yǎng)基中加入Akt酶抑制劑LY294002)。細胞培養(yǎng)24小時后，取HSEC上清液測定HGF、IL-6、NO和NOS濃度。具體方法參照酶鏈免疫試劑盒說明書。 第三部分：實驗動物同第一部分，H3-TDR(購自中國軍事醫(yī)學科學院，西南醫(yī)院核醫(yī)學科提供)，流式細胞分析儀(由第三軍醫(yī)大學基礎教研室提供)。實驗分組同第一部分，肝切除動物模型及肝竇內皮細胞分離與培養(yǎng)均同第一部分。肝竇內皮細胞分

7、別培養(yǎng)于6孔板(內置有膠原包被的蓋玻片)和96孔板(取10復孔)，均分兩組即A組(肝切除組)，和B組(肝切除+LY294002)，6孔板中每組取3復孔，96孔板中每組取5復孔。其中96孔板中細胞在培養(yǎng)18小時候每孔加入10ulH3-TDR，共培養(yǎng)24小時后，96孔板中細胞送核醫(yī)學科行細胞H3-TDR摻入率測定。利用放射免疫組化方法測定細胞H3-TDR摻入率。6孔板中培養(yǎng)的肝竇內皮細胞經收集后使用流式細胞分析儀分析細胞增殖周期，具體方法參

8、照使用說明書。 結果 第一部份 1.經過多次實驗，梯度離心后肝竇內皮細胞為(2.79±0.63)×107/只大鼠，經過選擇性貼壁后為(2.06±0.35)×107/只大鼠，經臺盼藍染色實驗測定細胞活性為(92±0.4)％。 2.大部分細胞光鏡下為小圓形，大小均一，2小時后貼壁，出現(xiàn)三角形或不規(guī)則形，5小時候出現(xiàn)典型的細胞形態(tài)出現(xiàn)，8小時候細胞成團，形成單層卵石樣結構，密度較稀的部位，出現(xiàn)樹枝狀或網狀相連，

9、此為HSEC特征性排列，隨著時間延長，HSEC形態(tài)逐漸變典型，呈梭形，細胞邊緣清楚，細胞核突起于中央。 3.培養(yǎng)48小時HSEC的純度達到90％左右。掃描電鏡顯示肝竇內皮細胞表面有典型的“窗孔”結構，大部分細胞CD14染色陽性，陽性染色位于細胞漿中。 4.HSEC中Akt蛋白在肝切除術后即開始增加，在術后24h點達到高峰(P＜0.01)。說明肝切除術后早期，Akt蛋白合成增加；而活化后的Akt酶的含量在術后2h點即明顯升

10、高(P＜0.01)，說明肝切除術后早期出現(xiàn)Akt酶的磷酸化過程；使用LY294002后Akt蛋白的活性及含量均呈抑制狀態(tài)，說明LY294002不僅抑制Akt的磷酸化，而且也影響Akt蛋白的合成。 5.HSEC中NF-κB的變化與活化的Akt酶變化類似，作為PI3K/Akt信號傳導的下游分子，其活化狀態(tài)受上游Akt磷酸化的影響，LY294002同樣抑制HSEC的NF-κB的磷酸化。 第二部份 1.HSEC分泌HGF

11、、IL-6的變化：SO組在術后72h內變化不大；而PH組在術后6h點，與LY組分泌的HGF、IL-6有明顯差異；術后24h分泌含量達到高峰，且二組之間有顯著性差異(P＜0.01)。此后隨著時間的延長，HSEC分泌HGF、IL-6的量逐漸降低，至72h三組基本一致。 2.HSEC分泌NOS、NO變化：在PH組，HSEC分泌NOS、NO的量緩慢增加，在6h達到高峰，此后逐漸下降。而LY組NOS、NO的量持續(xù)升高，在24h達到高峰，并

12、反超PH組，此后略有下降。除在術后24h點處，P值＜0.05外，其余各時相點之間比較均無統(tǒng)計學意義。 第三部分 1.在術后6小時時相點兩組肝竇內皮細胞H3-TDR摻入率分別為：8426.3±979.2；5735.6±1993.0。在統(tǒng)計學上有顯著差異(P＜0.05)。在術后24小時點兩組肝竇內皮細胞H3-TDR摻入率分別為：10215.0±1853.8；6260.3±1187.9。在統(tǒng)計學上有非常顯著差異(P＜0.01)

13、。在術后72小時點兩組肝竇內皮細胞H3-TDR摻入率在統(tǒng)計學上有顯著差異(P＜0.05)。從組內比較看，PH組隨時間的變化細胞H3-TDR摻入率在持續(xù)增加，從術后2h即有明顯變化；而LY組在術后2h-24h內變化緩慢，在24h與PH組相差最顯著。 2.流式細胞分析儀分析肝細胞增殖周期，與LY組相比，PH組G0/G1期細胞逐漸降低，S期和G2/M期細胞明顯增加，在術后6-72h時相點與LY組有明顯差異(P＜0.05)。與此同時，凋