大鼠肝部分切除術(shù)后肝竇內(nèi)皮細(xì)胞PI3K-Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路變化實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)分三個(gè)部分：1建立大鼠肝臟原位加體外循環(huán)膠原酶灌注、Percoll密度梯度離心法分離與培養(yǎng)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞，觀察Akt蛋白及NF-κB在肝切除術(shù)后肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)。2觀察PI3K/Akt對(duì)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞分泌HGF、IL-6、NO和NOS等細(xì)胞因子功能的影響。3通過觀察PI3K/Akt對(duì)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞DNA合成及細(xì)胞周期的影響來探討它對(duì)肝部分切除術(shù)后可能通過啟動(dòng)和促進(jìn)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞各項(xiàng)功能，從而在肝再生發(fā)生中起到重要的作用。

2、 材料和方法 第一部分：Sprague-Dawley大鼠，雄性，體重在190-210g，平均體重200±3.5g，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。CollagenaseⅣ、GBSS、購自美國Sigma公司，膠原酶S、膠原酶Ⅳ、DnaseⅠ、表皮生長因子(EGF，Cat.NO.1033476)。Percoll購自美國Pharmacia公司，CD14多抗(美國Santacruz)。CS-15高速冷凍離心機(jī)(美國Beckman

3、公司)。Akt單抗購自美國SantaCraz公司，LY294002購自美國Promega公司。采用Higgins&Aderson創(chuàng)建的經(jīng)典大鼠肝部分切除術(shù)模型，即分別于肝左葉、中葉根部結(jié)扎切除。計(jì)算大鼠肝切除率，在術(shù)后0h、6h、24h、48h、72h五個(gè)不同的時(shí)相點(diǎn)，分離肝竇內(nèi)皮細(xì)胞。HSEC分離方法采用肝臟原位勻速加離體循環(huán)膠原酶灌注、percoll密度梯度離心方法，得到HSEC沉淀，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為(1.2-1.5)×10

4、6/ml，經(jīng)37℃，5％CO2孵育20分鐘，待細(xì)胞選擇性貼壁后，收集未貼壁的細(xì)胞懸液，培養(yǎng)于24孔板(內(nèi)置有膠原包被的蓋玻片)，孵箱培養(yǎng)5小時(shí)后更換培養(yǎng)液，此后每兩天換液一次。通過臺(tái)盼藍(lán)染色判斷測定細(xì)胞活性，CD14多抗免疫細(xì)胞化學(xué)染色及用掃描電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)鑒定HSEC。細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，裂解細(xì)胞提取胞漿蛋白，作Westernblot觀察HSEC中Akt蛋白、磷酸化Akt及NF-κB的表達(dá)。 第二部分：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物同第一部份，N

5、O和NOS檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；大鼠HGF和IL-6ELISAKIT購自美國TPI公司；百樂405型酶標(biāo)儀；Phamacia分光光度計(jì)。采用Higgins&Aderson創(chuàng)建的經(jīng)典大鼠肝部分切除術(shù)模型，即分別于肝左葉、中葉根部結(jié)扎切除。計(jì)算大鼠肝切除率，在術(shù)后0h、6h、24h、48h、72h五個(gè)不同的時(shí)相點(diǎn)，分離肝竇內(nèi)皮細(xì)胞，分離方法同第一部份，HSEC細(xì)胞培養(yǎng)方法同第一部分；每時(shí)相點(diǎn)分為三組培養(yǎng)：SO組(假手術(shù)組)、

6、PH組(行肝部分切除組)、LY組(肝部分切除術(shù)后培養(yǎng)基中加入Akt酶抑制劑LY294002)。細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，取HSEC上清液測定HGF、IL-6、NO和NOS濃度。具體方法參照酶鏈免疫試劑盒說明書。 第三部分：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物同第一部分，H3-TDR(購自中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，西南醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科提供)，流式細(xì)胞分析儀(由第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)教研室提供)。實(shí)驗(yàn)分組同第一部分，肝切除動(dòng)物模型及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞分離與培養(yǎng)均同第一部分。肝竇內(nèi)皮細(xì)胞分

7、別培養(yǎng)于6孔板(內(nèi)置有膠原包被的蓋玻片)和96孔板(取10復(fù)孔)，均分兩組即A組(肝切除組)，和B組(肝切除+LY294002)，6孔板中每組取3復(fù)孔，96孔板中每組取5復(fù)孔。其中96孔板中細(xì)胞在培養(yǎng)18小時(shí)候每孔加入10ulH3-TDR，共培養(yǎng)24小時(shí)后，96孔板中細(xì)胞送核醫(yī)學(xué)科行細(xì)胞H3-TDR摻入率測定。利用放射免疫組化方法測定細(xì)胞H3-TDR摻入率。6孔板中培養(yǎng)的肝竇內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)收集后使用流式細(xì)胞分析儀分析細(xì)胞增殖周期，具體方法參

8、照使用說明書。 結(jié)果 第一部份 1.經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)，梯度離心后肝竇內(nèi)皮細(xì)胞為(2.79±0.63)×107/只大鼠，經(jīng)過選擇性貼壁后為(2.06±0.35)×107/只大鼠，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞活性為(92±0.4)％。 2.大部分細(xì)胞光鏡下為小圓形，大小均一，2小時(shí)后貼壁，出現(xiàn)三角形或不規(guī)則形，5小時(shí)候出現(xiàn)典型的細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)，8小時(shí)候細(xì)胞成團(tuán)，形成單層卵石樣結(jié)構(gòu)，密度較稀的部位，出現(xiàn)樹枝狀或網(wǎng)狀相連，

9、此為HSEC特征性排列，隨著時(shí)間延長，HSEC形態(tài)逐漸變典型，呈梭形，細(xì)胞邊緣清楚，細(xì)胞核突起于中央。 3.培養(yǎng)48小時(shí)HSEC的純度達(dá)到90％左右。掃描電鏡顯示肝竇內(nèi)皮細(xì)胞表面有典型的“窗孔”結(jié)構(gòu)，大部分細(xì)胞CD14染色陽性，陽性染色位于細(xì)胞漿中。 4.HSEC中Akt蛋白在肝切除術(shù)后即開始增加，在術(shù)后24h點(diǎn)達(dá)到高峰(P＜0.01)。說明肝切除術(shù)后早期，Akt蛋白合成增加；而活化后的Akt酶的含量在術(shù)后2h點(diǎn)即明顯升

10、高(P＜0.01)，說明肝切除術(shù)后早期出現(xiàn)Akt酶的磷酸化過程；使用LY294002后Akt蛋白的活性及含量均呈抑制狀態(tài)，說明LY294002不僅抑制Akt的磷酸化，而且也影響Akt蛋白的合成。 5.HSEC中NF-κB的變化與活化的Akt酶變化類似，作為PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)的下游分子，其活化狀態(tài)受上游Akt磷酸化的影響，LY294002同樣抑制HSEC的NF-κB的磷酸化。 第二部份 1.HSEC分泌HGF

11、、IL-6的變化：SO組在術(shù)后72h內(nèi)變化不大；而PH組在術(shù)后6h點(diǎn)，與LY組分泌的HGF、IL-6有明顯差異；術(shù)后24h分泌含量達(dá)到高峰，且二組之間有顯著性差異(P＜0.01)。此后隨著時(shí)間的延長，HSEC分泌HGF、IL-6的量逐漸降低，至72h三組基本一致。 2.HSEC分泌NOS、NO變化：在PH組，HSEC分泌NOS、NO的量緩慢增加，在6h達(dá)到高峰，此后逐漸下降。而LY組NOS、NO的量持續(xù)升高，在24h達(dá)到高峰，并

12、反超PH組，此后略有下降。除在術(shù)后24h點(diǎn)處，P值＜0.05外，其余各時(shí)相點(diǎn)之間比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 第三部分 1.在術(shù)后6小時(shí)時(shí)相點(diǎn)兩組肝竇內(nèi)皮細(xì)胞H3-TDR摻入率分別為：8426.3±979.2；5735.6±1993.0。在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異(P＜0.05)。在術(shù)后24小時(shí)點(diǎn)兩組肝竇內(nèi)皮細(xì)胞H3-TDR摻入率分別為：10215.0±1853.8；6260.3±1187.9。在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有非常顯著差異(P＜0.01)

13、。在術(shù)后72小時(shí)點(diǎn)兩組肝竇內(nèi)皮細(xì)胞H3-TDR摻入率在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異(P＜0.05)。從組內(nèi)比較看，PH組隨時(shí)間的變化細(xì)胞H3-TDR摻入率在持續(xù)增加，從術(shù)后2h即有明顯變化；而LY組在術(shù)后2h-24h內(nèi)變化緩慢，在24h與PH組相差最顯著。 2.流式細(xì)胞分析儀分析肝細(xì)胞增殖周期，與LY組相比，PH組G0/G1期細(xì)胞逐漸降低，S期和G2/M期細(xì)胞明顯增加，在術(shù)后6-72h時(shí)相點(diǎn)與LY組有明顯差異(P＜0.05)。與此同時(shí)，凋