MAPK信號(hào)通路對(duì)肝癌細(xì)胞乙酰肝素酶表達(dá)調(diào)節(jié)作用的研究.pdf

1、目的：肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國(guó)最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，且近年來(lái)其發(fā)病率和死亡率有逐年升高的趨勢(shì)。由于其具有侵襲性強(qiáng)，易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性，目前包括手術(shù)、放療、化療等各種治療方法的效果均不夠理想。因此，明確其侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生機(jī)制和探索新的、有效的治療方法己成為當(dāng)前腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)課題。乙酰肝素酶(heparanase，hpa)是目前發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中唯一能切割細(xì)胞外基質(zhì)中硫酸乙酰

2、肝素蛋白聚糖側(cè)鏈的內(nèi)源性糖苷酶，在腫瘤組織中廣泛表達(dá)，通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)和血管基底膜、釋放和活化線形硫酸乙酰肝素側(cè)鏈結(jié)合型的生長(zhǎng)因子(如bFGF、VEGF等)誘導(dǎo)血管生成，對(duì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移起重要作用。有絲分裂原活化蛋白激酶(miotgo-nactivatde proteinkinase，MAKP)是MAKP信號(hào)通路的重要組成部分，它包括：細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extraeellularsignal-regulatedprotein

3、kinase，ERK)，c-Jun氨基末端激酶(c-JunN-terminalkinas，JNK)和p38，它們能將各種胞外信號(hào)轉(zhuǎn)入胞內(nèi)，在細(xì)胞增殖、分化、生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化和凋亡中起重要作用。IL-1β是由多種免疫細(xì)胞產(chǎn)生和分泌的較為重要且具有代表性的細(xì)胞因子，可以通過(guò)MAKP信號(hào)通路發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等多種生物學(xué)作用。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)IL-1β促進(jìn)肝癌細(xì)胞Hpa表達(dá)。Hpa表達(dá)的調(diào)節(jié)是否與MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路有關(guān)尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通

4、過(guò)應(yīng)用PD98059(ERK1抑制劑)、SP600125(JNK1抑制劑)、SB203580(p38抑制劑)處理SMMC－7721肝癌細(xì)胞，觀察Hpa mRNA和蛋白表達(dá)的變化，明確MAPK三條主要通路與Hpa表達(dá)之間的關(guān)系，為進(jìn)一步探討肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制以及以Hpa為新靶點(diǎn)的治療方法提供新思路?！　》椒ǎ焊伟┘?xì)胞系SMMC-7721分對(duì)照組和試驗(yàn)組。對(duì)照組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，試驗(yàn)組細(xì)胞分別施加IL-1β、PD98059(ERK1抑制劑)

5、、SP600125(JNK1抑制劑)、SB203580(p38抑制劑)干預(yù)，設(shè)濃度梯度和時(shí)間梯度。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)，測(cè)定細(xì)胞Hpa mRNA表達(dá)的變化，以β-actin作為內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)凝膠掃描儀對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA電泳條帶的光密度值分析，將Hpa與β-actin比值作為Hpa mRNA表達(dá)水平的參數(shù)，對(duì)Hpa產(chǎn)物相對(duì)定量：以Western blot方法檢測(cè)SMMC-7721細(xì)胞胞漿Hpa蛋白表達(dá)的變化，

6、同樣以β-actin作為內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)Hpa蛋白進(jìn)行相對(duì)定量分析。所有數(shù)據(jù)均以(-x)±s表示，采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)和t檢驗(yàn)。P＜0.05為有顯著差異。 結(jié)果： 1.IL-1β作用相同時(shí)間后，SMMC-7721細(xì)胞Hpa mRNA和蛋白的表達(dá)較對(duì)照組顯著增高。 2.PD98059干預(yù)組與對(duì)照組比較Hpa mRNA的表達(dá)差異無(wú)顯著性；SP600125干預(yù)組與對(duì)照組比較Hp

7、a mRNA的表達(dá)差異無(wú)顯著性；SB203580干預(yù)組與對(duì)照組比較Hpa mRNA的表達(dá)顯著降低，且具有濃度依賴性(P＜0.05)。 3.PD98059干預(yù)組與對(duì)照組比較Hpa蛋白的表達(dá)顯著降低(P＜0.05)：SP600125干預(yù)組與對(duì)照組比較Hpa蛋白的表達(dá)顯著降低(P＜0.05)；SB203580干預(yù)組與對(duì)照組比較Hpa蛋白的表達(dá)顯著降低(P＜0.05)，以上三組均具有濃度依賴性。4在加入0.5 ng/ml的IL-1β干預(yù)

8、同時(shí)分別加入不同濃度的PD98059；SP600125；SB203580培養(yǎng)12小時(shí)的分組實(shí)驗(yàn)中，在PD98059和SP600125干預(yù)組與對(duì)照組比較，肝癌細(xì)胞HpamRNA和Hpa蛋白的表達(dá)差異無(wú)顯著性(P＞0.05)，在SB203580干預(yù)組中細(xì)胞Hpa mRNA和Hpa蛋白的表達(dá)顯著低于對(duì)照組，且具有濃度依賴性(P＜0.05)。 結(jié)論： 1.IL-1β對(duì)SMMC-7721細(xì)胞Hpa mRNA和Hpa蛋白的表達(dá)有上調(diào)