TLR4信號途徑對肝星狀細胞基因表達網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)作用以及對肝星狀細胞—肝癌細胞間相互作用的影響.pdf

1、第一部分 Toll樣受體4信號途徑對肝星狀細胞基因表達網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)作用
　　目的:研究Toll樣受體4(TLR4)信號途徑對肝星狀細胞(HSC)基因表達網(wǎng)絡(luò)的影響，以進一步明晰TLR4信號在HSC生物學特性中所起的作用。
　　方法:采用高通量全基因組mRNA表達譜芯片的方法，檢測野生型(JS1)和TLR4基因敲除型(JS2)小鼠肝星狀細胞株在基礎(chǔ)及TLR4外源性病原模式配體內(nèi)毒素(LPS)和內(nèi)源性損傷模式配體高遷移率族蛋白B1

2、(HMGB1)刺激下的基因表達譜;采用limma算法篩選差異基因;Fisher檢驗對差異基因進行功能顯著性分析(GO-Analysis)得到差異基因所顯著影響的功能;采用Fisher精確檢驗進行差異基因信號傳導通路的顯著性分析(Pathway-Analysis)，并對多重假設(shè)檢驗的結(jié)果進行校正和獲得誤判率(FDR);以顯著性Pathway中所參與的基因為研究對象，基于KEGG數(shù)據(jù)庫的基因間相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)進行整合，得到差異基因間的相互作

3、用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)(Gene-Act-Net)，獲得差異基因構(gòu)成的信號轉(zhuǎn)導流程以及差異基因中處于中樞的核心調(diào)控基因;以顯著性GO與顯著性Pathway中的基因取交集，以交集基因為研究對象，根據(jù)表達譜芯片的信號值，分別構(gòu)建Control組和Case組的共表達網(wǎng)絡(luò)，聚焦起核心作用的基因群體。并用拓撲分析法對LPS、HMGB1刺激下JS1、JS2細胞中的交集差異基因進行模塊分析，獲得主要的TLR4依賴的差異表達基因歸屬的功能模塊。
　　結(jié)果:1

4、.JS1與JS2相比較在基礎(chǔ)條件下（無外加內(nèi)外源配體刺激）基因轉(zhuǎn)錄譜有顯著差別，差異基因分析得到5421個差異探針，其中上調(diào)基因2748個，下調(diào)基因2673個，這些基因中包括:纖維化發(fā)生相關(guān)基因（如ColⅠ、ColⅢ、FN1）、基質(zhì)重構(gòu)(TIMP2、TIMP3、MMP2)、生長因子及受體(VEGFD、FGF7、IGF1及IGF1R、PDGFα及PDFGRα、PDGFRβ)、趨化因子及受體(CXCL12、CXCL11、CXCR7)、炎癥與

5、免疫(IL6)、轉(zhuǎn)錄因子(Jun、STAT3)及重要信號分子(MAPK1)等。功能及信號通路分析顯示這些基因主要與纖維化、炎癥與免疫、細胞周期、凋亡、腫瘤等相關(guān)，并可參與腫瘤、NOD-樣受體信號、mTOR信號、JAK-STAT信號、趨化因子信號、細胞粘附信號及免疫相關(guān)信號等的調(diào)節(jié)?；蛳嗷プ饔镁W(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果示Pik3r3、多種組織相容復合物H2家族分子、MAPK1及3、PDGFRα及β、JAK2、PTK2、PRKCA、integrinα及

6、β分子、IGF1及其受體、Jun等可能是基因表達網(wǎng)絡(luò)的核心調(diào)控因子。共表達分析顯示TLR4、Selp、GSK3β、Ephb3、SDC3、Atp6ap1、FZD4、integrinβ5、PAK3、FN1、Dapk1、Rps6ka1、Sema4f、 caspase3、Fcgr3、Pias1等是兩種細胞差異基因表達中起核心調(diào)控作用的基因群體。2.LPS或HMGB1刺激下JS1、JS2兩種細胞的轉(zhuǎn)錄譜改變有顯著差別，功能分析示這些差異基因主要影

7、響HSC代謝、增殖、凋亡、免疫等功能。信號通路分析示:在JS1中，LPS可上調(diào)參與Toll樣受體信號、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號、免疫相關(guān)信號、剪接體和核苷酸切除修復等信號通路的基因，下調(diào)PPAR信號通路;在JS2中，LPS可下調(diào)PPAR信號、腎素-血管緊張素信號?；蛳嗷プ饔镁W(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果示TLR4完整的JS1細胞中LPS刺激下多種組織相容復合物2分子(如H2-B1、H2-Q2、H2-Q10、H2-T10)、MAPK及激酶分子、Pik3r3、PR

8、KCA、Iκbκb等是基因表達網(wǎng)絡(luò)的核心調(diào)控因子;HMGB1刺激下多種MAPK及激酶分子、TRAF6、IGF1R、GPX4、Cyp2e1、Gstp、Gsst、Mgst3等是基因表達網(wǎng)絡(luò)的核心調(diào)控因子;JS2細胞中LPS及HMGB1刺激下差異表達基因相互作用網(wǎng)絡(luò)簡單并缺少顯著核心調(diào)控因子。共表達分析顯示JS1細胞在LPS刺激后多種MAPK及激酶分子、PDGFα、Herc1、Rb1、FGF18、CDK4、CDK7、PRKCA等是起核心調(diào)控作

9、用的基因群體;HMGB1刺激下Herc1、JAK1、ODC1、Hist4h4、TRAF6、MAPK、PRKCA等起到核心調(diào)控作用;在JS2細胞中LPS或HMGB1刺激下共表達網(wǎng)絡(luò)群體與JS1細胞缺少相似性。3.拓撲分析TLR4依賴的LPS及HMGB1共同誘導的差異基因，獲得29個主要的功能模塊，主要影響細胞骨架形成、脂肪代謝、整合素信號傳導通路、氧化應(yīng)激、趨化因子及受體、跨膜受體信號傳導、免疫等方面的功能。
　　結(jié)論:TLR4信號

10、途徑對基礎(chǔ)及TLR4內(nèi)外源性配體刺激下HSC基因轉(zhuǎn)錄譜的改變有重要影響，參與調(diào)節(jié)HSC的纖維化發(fā)生、炎癥和趨化特性，以及生長、凋亡和代謝等多方面的功能相關(guān)基因的表達。
　　第二部分 Toll樣受體4信號途徑對肝星狀細胞-肝癌細胞間相互作用的影響
　　目的:研究Toll樣受體4(TLR4)信號途徑介導的肝星狀細胞(HSC)對肝癌細胞(HCC)生物學特性的影響和機制。
　　方法:采用實時熒光定量PCR法、Western B

11、lot法、酶聯(lián)免疫法(ELISA)從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平驗證差異基因的表達和其中分泌型蛋白的分泌;采用野生型(JS1)及TLR4基因敲除型(JS2)肝星狀細胞和肝癌細胞(HepG2、Hepa1-6)間接共培養(yǎng)法及CCK8法檢測兩種HSC對肝癌細胞增殖的影響。
　　結(jié)果:1.與JS2細胞相比，JS1細胞中纖維化相關(guān)基因ColⅠ、ColⅢ、FN1，轉(zhuǎn)錄因子SP1、STAT3、Fas及細胞生長和炎癥趨化因子FGF7、IGF1、FIGF、IL6

12、、CXCL12、CXCR7等的mRNA表達水平明顯上調(diào);ColⅠ、MMP2、DLK1、IGF1、FIGF、CXCL12的蛋白水平上調(diào);而PDGFα、CXCL11、CXCR4的mRNA表達無明顯變化。2.JS1、JS2均可促進HepG2、Hepa1-6細胞的增殖，但以JS1的作用較為明顯。
　　結(jié)論:TLR4信號途徑介導HSC的纖維化發(fā)生、炎癥表型等重要生物學特性，并介導HSC表達趨化因子CXCL12及受體CXCR7，以及生長因子V