基底-細胞系統(tǒng)剛度對肝細胞和肝癌細胞遷移的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、肝癌是我國惡性腫瘤中死亡率最高的癌癥之一。在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中，肝癌組織的硬度逐漸升高，肝癌的發(fā)展過程可以看作是腫瘤細胞應對硬化組織環(huán)境的一個病態(tài)響應過程，其中腫瘤細胞離開原發(fā)病灶向臨近組織侵襲，以及借血路和淋巴道向遠端轉(zhuǎn)移均涉及細胞的遷移行為。腫瘤細胞的遷移依賴于腫瘤細胞和細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)之間特殊的理化作用。當細胞與基底接觸，細胞通過粘附分子將細胞骨架和細胞外基質(zhì)耦聯(lián)在一起。這樣，ECM

2、-粘附分子-細胞骨架-細胞核形成了一個完整的大骨架網(wǎng)絡系統(tǒng)。大骨架網(wǎng)絡系統(tǒng)作為“力學感受器”，使細胞可感知細胞外的力學信號變化，并沿此“軌道”實現(xiàn)細胞內(nèi)外信號的雙向傳導，從而調(diào)節(jié)細胞的遷移。除了基底剛度的改變，由于腫瘤細胞骨架發(fā)育的缺陷，腫瘤細胞的硬度比同組織來源的正常細胞低。腫瘤組織的硬化和腫瘤細胞的軟化將影響細胞與其所黏附基底之間的力平衡。這些改變是否會影響細胞對細胞外信號的感知和傳遞，并對腫瘤細胞的遷移行為產(chǎn)生怎樣的影響仍不清楚。

3、本研究通過分析高轉(zhuǎn)移肝癌細胞株(HCCLM3，簡稱M3)對不同基底剛度的響應來研究基底剛度和細胞剛度的相互作用對肝癌細胞遷移行為的影響，并以肝細胞(L02)作為對照。我們的主要研究內(nèi)容包括：
　　 ①基于體系最小自由能原則構(gòu)建數(shù)學模型來模擬不同硬度基底上細胞形態(tài)的變化。結(jié)果顯示，細胞的形態(tài)是通過細胞-基底系統(tǒng)中介面能和張力能之間的競爭，由系統(tǒng)最小自由能來調(diào)控的。當基底的化學環(huán)境因素保持不變時，細胞形態(tài)穩(wěn)定性由細胞-基底系統(tǒng)的剛度

4、決定。細胞形態(tài)對基底剛度呈雙向響應，響應的范圍取決于細胞外配體的濃度。細胞對基底剛度的響應范圍可來用來估測細胞的“內(nèi)在硬度”。
　　 ②通過制備不同硬度的聚丙烯酰胺基底，觀察正常肝細胞和肝癌細胞在不同的基底剛度和配體濃度上細胞骨架裝配，鋪展面積，周長，和形態(tài)因子的變化。并用原子力顯微鏡檢測基底剛度對細胞剛度的影響。結(jié)果顯示，實驗結(jié)果與數(shù)學模型中的預測相符合。細胞周長和投影面積的增長以及肌動蛋白骨架纖維的裝配都依賴于基底剛度。在一

5、定的硬度范圍內(nèi)(細胞對基底剛度響應的敏感區(qū)域)細胞的周長，投影面積的增長和肌動蛋白骨架纖維的裝配與基底剛度呈函數(shù)關(guān)系。胞外配體濃度的增加使細胞對基底剛度敏感響應的范圍縮小。基于在不同硬度基底上細胞形態(tài)的變化，通過細胞因子的變化趨勢來預估細胞的“內(nèi)在硬度”發(fā)現(xiàn)正常肝細胞的硬度高于高轉(zhuǎn)移的肝癌細胞，這與原子力顯微鏡所檢測鋪展細胞的“表觀硬度”結(jié)果相一致。
　　 ③利用不同硬度聚丙烯酰胺基底研究基底剛度和細胞剛度的相互作用對正常肝細胞

6、和肝癌細胞遷移速度的影響。首先用原子力顯微鏡分別檢測肝細胞和肝癌細胞在不同硬度基底上細胞模量的變化。接著，用免疫熒光和Western Blot的方法檢測不同硬度基底上細胞骨架纖維的交聯(lián)程度。最后用流式細胞儀檢測細胞表面整合素β1的表達。結(jié)果顯示，肝細胞和肝癌細胞可調(diào)整其自身硬度與所黏附基底剛度相適應，但是二者的調(diào)節(jié)能力不同。肝細胞響應的硬度范圍大約從3.6 kPa到非常硬的玻璃基底，而肝癌細胞響應的硬度范圍相對較軟，大約從1.1 kPa

7、到33.7kPa。在這個硬度范圍內(nèi)，細胞actin纖維的裝配和整合素β1的表達有明顯的增加。對細胞遷移的分析發(fā)現(xiàn)，肝細胞在相對較硬(33.7kPa)的基底上運動比較快，而肝癌細胞則在相對較軟(3.6 kPa)的基底上運動比較快。這些結(jié)果提示肝細胞和肝癌細胞對基底剛度不同的響應能力可能造成了與其細胞骨架的裝配和整合素β1的表達的差異相關(guān)從而影響細胞的遷移速度。
　　 ④利用不同硬度的聚丙烯酰胺基底研究基底剛度和細胞剛度的相互作用對

8、細胞遷移模式的影響。通過原子力顯微鏡檢測細胞剛度，time-lapse顯微鏡記錄不同硬度基底上細胞形態(tài)和遷移的變化，并用免疫熒光技術(shù)觀察基底剛度對細胞骨架排列的影響?；讋偠葘毎鹀ofilin和整合素β1表達的影響用Western Blot檢測，細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶-2(Matrix metalloproteinase-2，MMP-2)的表達用明膠酶譜法檢測，并用Transwell小室檢測細胞在三維基質(zhì)中的侵襲效率。結(jié)果顯示，硬基底可

9、通過促進細胞骨架裝配，增加細胞剛度，并通過調(diào)節(jié)MMPs分泌和整合素的表達等來促進細胞間充質(zhì)樣的遷移；而軟基底則可以通過形成皮質(zhì)下環(huán)狀排列的骨架纖維，提高細胞的柔韌性，減少MMPs的分泌和整合素的表達來誘導細胞阿米巴樣的遷移，從而提高細胞的侵襲效率。其中肝細胞可在硬基底上以典型的間充質(zhì)樣運動方式遷移，但肝癌細胞卻不能。與之相反的，軟基底可誘導大多數(shù)肝癌細胞表現(xiàn)出阿米巴樣遷移的潛能而只有少數(shù)肝細胞表現(xiàn)出阿米巴運動的活力。這些結(jié)果提示基底的硬

10、度，它作為一個力學調(diào)控因子，可以放大細胞的間充質(zhì)或阿米巴運動的潛能。但是細胞是選擇一種遷移模式或者是幾種遷移模式的混合，則主要取決于細胞自身的特性(如細胞剛度和相關(guān)蛋白的基礎表達水平)。
　　 基于以上的研究結(jié)果我們認為在細胞對基底剛度的感知和響應中，基底剛度和細胞剛度的共同作用比單一的基底剛度起的作用更重要?；讋偠群图毎麆偠茸鳛橐环N物理因素，主要影響細胞對基底剛度的感知范圍，并在不同的硬度范圍內(nèi)調(diào)節(jié)相關(guān)信號蛋白的表達水平從而