WNT5A在鼻咽癌轉(zhuǎn)移中的作用及BMI-1對(duì)鼻咽癌細(xì)胞藥敏性的影響.pdf

1、第一部分 WNT5.A/PCK介導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與鼻咽癌轉(zhuǎn)移 研究背景: 鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國(guó)華南地區(qū)及東南亞常見的一種惡性腫瘤。鼻咽癌的治療主要以放療為主，對(duì)放化療都比較敏感，早期療效好，而晚期鼻咽癌的療效甚差，并且有30％以上的鼻咽癌患者會(huì)產(chǎn)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，所以轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致鼻咽癌患者死亡的原因之一。但迄今為止，導(dǎo)致鼻咽癌轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制尚未明了。因此，探討鼻咽癌轉(zhuǎn)移的特征性基

2、因及其分子機(jī)制，對(duì)于找到鼻咽癌轉(zhuǎn)移治療的新靶點(diǎn)及提高轉(zhuǎn)移患者的生存率具有重大的意義。 WNT家族是一類含絲氨酸豐富的分泌性糖蛋白，包括19種成員，主要通過細(xì)胞表面受體調(diào)節(jié)特異性轉(zhuǎn)錄因子參與細(xì)胞生命調(diào)控、遷移以及細(xì)胞極化等。WNT信號(hào)通路能抑制凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，同時(shí)WNT家族及其成員也參與了多種腫瘤的發(fā)生，包括鼻咽癌。WNT5A被歸于WNT家族中無轉(zhuǎn)化能力的成員之一，主要參與了非經(jīng)典的WNT信號(hào)通路。有研究表明WNT5A

3、的表達(dá)增加與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但是WNT5A在鼻咽癌轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制尚不清楚。因此，本研究旨在探討WNT5A在鼻咽癌侵襲、轉(zhuǎn)移過程中的作用及其相關(guān)的分子機(jī)制。 1)WNT5A是鼻咽癌轉(zhuǎn)移的特征性分子之一 前期的研究已經(jīng)從人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2中分離出不同轉(zhuǎn)移能力的克隆細(xì)胞株Clone-18，Clone-22和Clone-26。其中Clone-18具有顯著的侵襲轉(zhuǎn)移能力，而親代鼻咽癌細(xì)胞株CNE2及其克隆Clone-

4、22.Clone-26的侵襲轉(zhuǎn)移能力較弱。對(duì)上述細(xì)胞我們通過全基因組表達(dá)基因的高通量分析，分別篩選出多個(gè)在Clone-18上調(diào)和下調(diào)的基因。對(duì)裸鼠移植瘤進(jìn)行全基因組表達(dá)基因的高通量分析，得出類似的結(jié)果，其中WNT5A在高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株Clone-18中的表達(dá)明顯上調(diào)。 2)高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株Clone-18發(fā)生EMT現(xiàn)象 光鏡觀察發(fā)現(xiàn)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2及其低轉(zhuǎn)移能力的克隆Clone-22和Clone-26呈現(xiàn)典型的上皮細(xì)胞形狀

5、，而高轉(zhuǎn)移細(xì)胞克隆Clone-18的形態(tài)則類似于成纖維細(xì)胞的形態(tài)。由于這種細(xì)胞形態(tài)的改變類似于細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變時(shí)的典型特征，于是檢測(cè)了相關(guān)的分子標(biāo)志物。在Clone-18中E-cadherin的表達(dá)明顯降低，而Snail的表達(dá)明顯增加。 3)抑制WNT5A的表達(dá)能降低高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株Clone-18的體外遷移和侵襲能力 為了闡明WNT5A對(duì)鼻咽癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響，設(shè)計(jì)了三條針對(duì)WNT5A mRNA的干擾序列，并篩選出

6、最有效的一條用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。通過劃痕實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了干擾WNT5A能有效降低Clone-18細(xì)胞株的遷移和侵襲能力。 4)抑制PKC的活性能降低高轉(zhuǎn)移細(xì)胞克隆Clone-18的運(yùn)動(dòng)能力 有研究報(bào)道在黑色素瘤細(xì)胞中PKC能介導(dǎo)WNT5A通過非經(jīng)典的WNT/Ca2+通路參與細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。另外在乳腺癌細(xì)胞中PKC的活化能反饋性的上調(diào)WNT5A的表達(dá)。因此我們研究PKC的抑制劑是否能阻礙高轉(zhuǎn)移細(xì)胞克隆Clone-18的運(yùn)

7、動(dòng)。GF-10923X是PKC的經(jīng)典抑制劑，能有效抑制Clone-18中PKC的磷酸化，導(dǎo)致PKC的失活，下調(diào)WNT5A的表達(dá)。同時(shí)影響到EMT標(biāo)志性分子的改變，即導(dǎo)致Snail表達(dá)的下降和增加E-cadherin的表達(dá)，最終降低Clone-18的運(yùn)動(dòng)能力。采用另一種PKC的抑制劑Go6983能產(chǎn)生類似的效果。因此，PKC參與了鼻咽癌細(xì)胞的EMT，調(diào)節(jié)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。 5)WNT5A通過PKC途徑調(diào)節(jié)鼻咽癌細(xì)胞EMT 由于W

8、NT5A能增加PKC的磷酸化，而PKC參與了細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，我們因此進(jìn)一步探究WNT5A是否能直接誘導(dǎo)細(xì)胞的EMT。在WNT5A被干擾之后，Clone-18中磷酸化PKC的表達(dá)顯著降低，而EMT的標(biāo)志性分子Snail表達(dá)下調(diào)，E-eadherin表達(dá)增加。而在低轉(zhuǎn)移細(xì)胞克隆Clone-22中加入外源性重組WNT5A蛋白后，Snail的表達(dá)增加，E-cadherin的表達(dá)下調(diào)，提示促進(jìn)了細(xì)胞發(fā)生EMT改變。 6)PKC的

9、活化通過調(diào)節(jié)Snail和E-cadherin的表達(dá)促進(jìn)低轉(zhuǎn)移細(xì)胞克隆的運(yùn)動(dòng) 為了進(jìn)一步研究PKC的激活是否能增強(qiáng)低轉(zhuǎn)移鼻咽癌細(xì)胞克隆的運(yùn)動(dòng)能力，我們采用PKC的激活劑佛波酯PMA來處理細(xì)胞。結(jié)果顯示當(dāng)采用低濃度的PMA(200nM)處理后，磷酸化PKC的表達(dá)在30分鐘左右達(dá)到頂峰，隨后緩慢地衰減，12小時(shí)至24小時(shí)左右表達(dá)最低。有趣的是，WNT5A和Snail的表達(dá)則隨著時(shí)間的延長(zhǎng)緩慢增加，12小時(shí)至24小時(shí)達(dá)最高，而E-cad

10、herin的表達(dá)卻是緩慢地減弱。正如所預(yù)測(cè)的，當(dāng)加入PMA或重組WNT5A因子之后，劃痕實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，但是這一運(yùn)動(dòng)能力可以被PKC抑制劑GO6983阻斷。 7)WNT5A的表達(dá)上調(diào)與鼻咽癌轉(zhuǎn)移的臨床相關(guān)性 我們也關(guān)心WNT5A促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞在體外的遷移侵襲能力是否具有臨床相關(guān)性。我們收集了49例臨床新鮮活檢組織樣本，包括20例非腫瘤的鼻咽黏膜組織樣本，19例鼻咽原位腫瘤樣本，5例鼻咽癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的穿刺活檢

11、樣本(局部轉(zhuǎn)移)，4例鼻咽癌肝轉(zhuǎn)移灶的穿刺活檢樣本(遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移)，進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)WNt5A的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示W(wǎng)NT5A在鼻咽癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的的mRNA表達(dá)水平顯著高于鼻咽原位腫瘤樣本，在鼻咽癌肝轉(zhuǎn)移樣本的表達(dá)顯著高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移樣本。但是WN74A的mRNA在非腫瘤鼻咽黏膜組織和鼻咽原位腫瘤的表達(dá)沒有顯著差異性。 結(jié)論: 1)WNT5A通過激活PKC通路，調(diào)節(jié)Snail和E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)

12、鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移； 2)PKC的激活劑PMA以及抑制劑GF-10923X和Go6983也能通過調(diào)節(jié)Snail和E-cadherin的表達(dá)，影響細(xì)胞EMT和鼻咽癌細(xì)胞的遷徙能力； 3)WNT5A與PKC之間存在反饋調(diào)控作用； 第二部分 BMl-1對(duì)鼻咽癌細(xì)胞藥敏性的影響 研究背景: 鼻咽癌的發(fā)生是多因素導(dǎo)致的一種惡性腫瘤，包括遺傳易感性、EB(Epstein-Barr)

13、病毒的感染以及其他環(huán)境因素等。目前，5-氟脲嘧啶是治療鼻咽癌的一線化療藥物。然而，有部分鼻咽癌患者在進(jìn)行5-氟脲嘧啶治療后出現(xiàn)復(fù)發(fā)甚至惡化，其主要原因是體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)了抗藥性。因此，如何增加腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性越來越受到重視。 BMI-1(B-cell-specific moloney leukemia virus insert sitel)屬于多梳基因家族抑制復(fù)合體PRCl(Polycomb Repressive Co

14、mplexl)的成員，被公認(rèn)為是一個(gè)癌基因。它在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，其表達(dá)與惡性腫瘤的進(jìn)程相關(guān)，并且與患者的生存預(yù)后密切相關(guān)。研究表明，BMI-1具有誘導(dǎo)細(xì)胞永生化，促進(jìn)腫瘤的早期轉(zhuǎn)化，維持及促進(jìn)干細(xì)胞的自我更新等重要功能。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道，BMI-1在鼻咽癌中高表達(dá)，且其表達(dá)水平與鼻咽癌原發(fā)灶的浸潤(rùn)范圍以及患者生存預(yù)后密切相關(guān)；而BMI-1的表達(dá)下調(diào)能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。因此我們假設(shè)BMI-1的下調(diào)能通過促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的凋亡而增加化

15、療藥物的敏感性，從而進(jìn)一步闡明其分子機(jī)制，旨在為解決腫瘤細(xì)胞的抗藥性提供新的藥物靶點(diǎn)。 1)BMI-1的干擾能增加鼻咽癌細(xì)胞對(duì)5-氟脲嘧啶的敏感性 在人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2和HONE1中，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒感染系統(tǒng)建立BMI-1穩(wěn)定干擾的細(xì)胞株即CNE2-BMI-1/RNAi，CNE2-vector和HONE1-BMI-1/RNAi，HONE1-vector。以上述細(xì)胞作為研究模型，加入不同濃度的5-氟脲嘧啶處理72小時(shí)，M

16、TT法檢測(cè)藥物的IC50值。結(jié)果顯示：CNE2-vector，CNE2-BMI-1/RNAi中5-氟脲嘧啶的IC50值分別為9.1504±0.6997 mg/L，3.1151±0.8073mg/L(P<0.05)；HONE1-vector，HONE1-BMI-1/RNAi中5-氟脲嘧啶的IC50值分別為3.9023±0.752 mg/L，1.5815±0.433 mg/L(P<0.05)。 2)BMI-1的干擾能增加5-氟脲嘧啶

17、誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞的凋亡 為了探討B(tài)MI-1干擾后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，采用5 mg/L5-氟脲嘧啶分別處理CNE2-vector，CNE2-BMI-1/RNAi細(xì)胞株72小時(shí)，Hoechst33258染色觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示，CNE2-BMI-1/RNAi細(xì)胞株出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)如細(xì)胞染色質(zhì)濃縮、核固縮，凋亡小體形成等。而CNE2-vector的凋亡形態(tài)改變相對(duì)不明顯。同時(shí)CNE2-BMI-1