酶標(biāo)納米金探針的制備及其檢測(cè)蛋白質(zhì)方法的研究.pdf

1、癌胚抗原(Carc inoembryonic antigen，CEA)是一種人類胚胎抗原決定簇的酸性糖蛋白，國(guó)內(nèi)外已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，肺癌患者血清CEA水平明顯高于正常對(duì)照組和良性肺病組患者，腺癌陽性率最高，因此CEA的監(jiān)測(cè)有助于提高對(duì)早期肺癌診斷的敏感性(曾顯聲和周燕斌，2007)但肺癌早期患者血清中的CEA含量極低，因此需建立高靈敏度的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法。 隨著納米科技的興起，納米金以其獨(dú)特的光學(xué)和電學(xué)性質(zhì)、良好的穩(wěn)定性、小尺寸和

2、表面效應(yīng)以及獨(dú)特的生物親和性，使其在疾病診斷領(lǐng)域顯示了潛在的價(jià)值。目前，有關(guān)利用納米金探針檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法已有許多報(bào)道，但這些方法普遍操作繁瑣費(fèi)時(shí)、儀器昂貴，僅能在少數(shù)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。因此有待于進(jìn)一步開發(fā)一些操作簡(jiǎn)便、可以通過普通儀器就可檢測(cè)的、仍具有高靈敏度的納米金探針檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法?；诖四康?，本研究構(gòu)建了一種新型納米金探針檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法：在磁珠上標(biāo)記捕獲抗體CEA制備磁珠探針，同時(shí)利用納米金對(duì)生物大分子的物理吸附特性，將檢測(cè)抗體C

3、EA與辣根過氧化物酶(Streptavidin-peroxidase，SA-HRP)標(biāo)記于納米金上制備成納米金探針，檢測(cè)過程中，磁珠探針、CEA抗原(檢測(cè)目標(biāo))、納米金探針三者通過免疫反應(yīng)形成三明治復(fù)合結(jié)構(gòu)，并利用磁珠的磁場(chǎng)效應(yīng)收集復(fù)合結(jié)構(gòu)，然后進(jìn)行酶促顯色反應(yīng)，于450nm處進(jìn)行分光光度檢測(cè)，間接測(cè)定CEA抗原(檢測(cè)目標(biāo))的含量，從而實(shí)現(xiàn)了通過普通光學(xué)儀器對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行高靈敏度檢測(cè)的目標(biāo)。就該檢測(cè)方法的建立本文主要做了以下一些工作：

4、 1.磁珠探針的標(biāo)記及表征 2.納米金探針標(biāo)記方法研究 3.納米金探針微量蛋白質(zhì)測(cè)定方法研究 結(jié)論： 1.經(jīng)熒光顯微鏡檢測(cè)表明CEA抗體標(biāo)記到了磁珠上，且免疫檢測(cè)表明標(biāo)記到磁珠上的抗體仍然具有活性。 2.經(jīng)最低蛋白穩(wěn)定量實(shí)驗(yàn)確定納米金標(biāo)記蛋白質(zhì)的最低穩(wěn)定量為0.6μl。納米金蛋白質(zhì)檢測(cè)方法的高靈敏度依賴于納米金上酶標(biāo)記數(shù)量的多寡。因此標(biāo)記納米金時(shí)檢測(cè)抗體CEA與SA-HRP的加入量要進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)

5、化。經(jīng)試驗(yàn)表明檢測(cè)抗體CEA(V)：SA-HRP(V)的理想比例為0.5μl:5μl/100μl納米金溶膠，在這種比例下既可以得到高的陽性A值而且陰性對(duì)照A值也會(huì)保持低的水平。另外納米金探針重懸液的選擇對(duì)于納米金探針的活性及存儲(chǔ)穩(wěn)定性具有關(guān)鍵的影響。經(jīng)試驗(yàn)表明50 mM Tris(pH7.8，1.25％蔗糖，0.2％BSA，0.05％PEG，0.05％PVP，0.15％Tween20)可以保持酶標(biāo)納米金探針的穩(wěn)定性及標(biāo)記物的蛋白活性和酶

6、活性，是理想的納米金探針重懸液。 3.酶標(biāo)納米金探針微量蛋白質(zhì)測(cè)定方法反應(yīng)條件的優(yōu)化：第一步孵育液為10mM PB(PH7.4，1％BSA，5％蔗糖，1％PEG，1％PVP，0.3％ween20)，第二步孵育液為10 mM PBS(PH7.4，0.1％BSA，0.05％Tween20)，酶標(biāo)納米金的加入量為3μl，兩步孵育的最適時(shí)間為第一步孵育時(shí)間1h，第二步孵育時(shí)間45 min。使用該方法檢測(cè)并繪制CEA標(biāo)準(zhǔn)曲線，表明CEA濃