蛋白質(zhì)提取與制備的原理和方法

1、蛋白質(zhì)提取與制備的原理和方法蛋白質(zhì)提取與制備的原理和方法蛋白質(zhì)提取與制備蛋白質(zhì)種類很多，性質(zhì)上的差異很大，既或是同類蛋白質(zhì)，因選用材料不同，使用方法差別也很大，且又處于不同的體系中，因此不可能有一個(gè)固定的程序適用各類蛋白質(zhì)的分離。但多數(shù)分離工作中的關(guān)鍵部分基本手段還是共同的，大部分蛋白質(zhì)均可溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液中，少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)溶于乙醇、丙酮及丁醇等有機(jī)溶劑中。因此可采用不同溶劑提取、分離及純化蛋白質(zhì)和酶。蛋白質(zhì)與酶在不

2、同溶劑中溶解度的差異，主要取決于蛋白分子中非極性疏水基團(tuán)與極性親水基團(tuán)的比例，其次取決于這些基團(tuán)的排列和偶極矩。故分子結(jié)構(gòu)性質(zhì)是不同蛋白質(zhì)溶解差異的內(nèi)因。溫度、pH、離子強(qiáng)度等是影響蛋白質(zhì)溶解度的外界條件。提取蛋白質(zhì)時(shí)常根據(jù)這些內(nèi)外因素綜合加以利用。將細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)提取出來。并與其它不需要的物質(zhì)分開。但動(dòng)物材料中的蛋白質(zhì)有些可溶性的形式存在于體液（如血漿、消化硫等）中，可以不必經(jīng)過提取直接進(jìn)行分離。蛋白質(zhì)中的角蛋白、膠原及絲蛋白等不溶性蛋

3、白質(zhì)，只需要適當(dāng)?shù)娜軇┫慈タ扇苄缘陌殡S物，如脂類、糖類以及其他可溶性蛋白質(zhì)，最后剩下的就是不溶性蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)經(jīng)細(xì)胞破碎后，用水、稀鹽酸及緩沖液等適當(dāng)溶劑，將蛋白質(zhì)溶解出來，再用離心法除去不溶物，即得粗提取液。水適用于白蛋白類蛋白質(zhì)的抽提。如果抽提物的pH用適當(dāng)緩沖液控制時(shí)，共穩(wěn)定性及溶解度均能增加。如球蛋白類能溶于稀鹽溶液中，脂蛋白可用稀的去垢劑溶液如十二烷基硫酸鈉、洋地黃皂苷（Digitonin）溶液或有機(jī)溶劑來抽提。其它不溶于

4、水的蛋白質(zhì)通常用稀堿溶液抽提。蛋白質(zhì)類別和溶解性質(zhì)白蛋白和球蛋白:溶于水及稀鹽、稀酸、稀堿溶液，可被50%飽和度硫酸銨析出。真球蛋白:一般在等電點(diǎn)時(shí)不溶于水，但加入少量的鹽、酸、堿則可溶解。擬球蛋白:溶于水，可為50%飽和度硫酸銨析出醇溶蛋白:溶于70～80%乙醇中，不溶于水及無水乙醇?xì)さ鞍?在等電點(diǎn)不溶于水，也不溶于稀鹽酸，易溶于稀酸、稀堿溶液精蛋白:溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀組蛋白:溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀硬蛋白質(zhì):不溶于

5、水、鹽、稀酸及稀堿綴合蛋白(包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血紅蛋白、金屬蛋白、黃素蛋白和氮苯蛋白等):此類蛋白質(zhì)溶解性質(zhì)隨蛋白質(zhì)與非蛋白質(zhì)結(jié)合部分的不同而異，除脂蛋白外，一般可溶于稀酸、稀堿及鹽溶液中，脂蛋白如脂肪部分露于外，則脂溶性占優(yōu)勢(shì)，如脂肪部分被包圍于分子之中，則水溶性占優(yōu)勢(shì)。蛋白質(zhì)的制備是一項(xiàng)十分細(xì)致的工作。涉及物理學(xué)、化學(xué)和生物學(xué)的知識(shí)很廣。近年來雖然有了不改進(jìn)，但其主要原理仍不外乎兩個(gè)方面：致活性喪失。因此選

6、擇的條件應(yīng)為十分溫和。同時(shí)應(yīng)注意防止系統(tǒng)中重金屬離子、細(xì)胞自身酶系及其他有毒物質(zhì)的污染。蛋白質(zhì)提取與制備的注意事宜蛋白質(zhì)提取與制備的注意事宜:一、原料的選擇早年為了研究的方便，盡量尋找含某種蛋白質(zhì)豐富的器官?gòu)闹刑崛〉鞍踪|(zhì)。但至目前經(jīng)常遇到的多是含量低的器官或組織且量也很小，如下丘腦、松果體、細(xì)胞膜或內(nèi)膜等原材料，因而對(duì)提取要求更復(fù)雜一些。原料的選擇主要依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?。從工業(yè)生產(chǎn)角度考慮，注意選含量高、來源豐富及成本低的原料。盡量要新鮮原

7、料。但有時(shí)這幾方面不同時(shí)具備。含量豐富但來源困難，或含量來源均理想，但分離純化操作繁瑣，反而不如含量略低些易于獲得純品者。一般要注意種屬的關(guān)系，如鰹的心肌細(xì)胞色素C較馬的易結(jié)晶，馬的血紅蛋白較牛的易結(jié)晶。要事前調(diào)查制備的難易情況。若利用蛋白質(zhì)的活性，對(duì)原料的種屬應(yīng)幾乎無影響。如利用胰蛋白酶水解蛋白質(zhì)的活性，用豬或牛胰臟均可。但若研究蛋白質(zhì)自身的性質(zhì)及結(jié)構(gòu)時(shí)，原料的來源種屬必須一定。研究由于病態(tài)引起的特殊蛋白質(zhì)（本斯.瓊斯氏蛋白、貧血血紅

8、蛋白）時(shí)，不但使用種屬一定的原料，而且要取自同一個(gè)體的原料?？赡軙r(shí)盡量用全年均可采到的原料。對(duì)動(dòng)物生理狀態(tài)間的差異（如饑餓時(shí)脂肪和糖類相對(duì)減少），采收期及產(chǎn)地等因素也要注意。二、前處理1、細(xì)胞的破碎材料選定通常要進(jìn)行處理。要剔除結(jié)締組織及脂肪組織。如不能立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，則應(yīng)冷凍保存。除了提取及胞細(xì)外成分，對(duì)細(xì)胞內(nèi)及多細(xì)胞生物組織中的蛋白質(zhì)的分離提取均須先將細(xì)胞破碎，使其充分釋放到溶液中。不同生物體或同一生物體不同的組織，其細(xì)胞破壞難易不一

9、，使用方法也不完全相同。如動(dòng)物胰、肝、腦組織一般較柔軟，作普通勻漿器磨研即可，肌肉及心組織較韌，需預(yù)先絞碎再制成勻槳。⑴機(jī)械方法主要通過機(jī)械切力的作用使組織細(xì)胞破壞。常用器械有：①高速組織搗碎機(jī)（轉(zhuǎn)速可達(dá)10000rpm，具高速轉(zhuǎn)動(dòng)的鋒利的刀片），宜用于動(dòng)物內(nèi)臟組織的破碎；②玻璃勻漿器（用兩個(gè)磨砂面相互摩擦，將細(xì)胞磨碎），適用于少量材料，也可用不銹鋼或硬質(zhì)塑料等，兩面間隔只有十分之幾毫米，對(duì)細(xì)胞破碎程度較高速搗碎機(jī)高，機(jī)械切力對(duì)分子破壞

10、較小。小量的也可用乳缽與適當(dāng)?shù)木彌_劑磨碎提取，也可加氧化鋁、石英砂及玻璃粉磨細(xì)。但在磨細(xì)時(shí)局部往往生熱導(dǎo)致變性或pH顯著變化，尤其用玻璃粉和氧化鋁時(shí)。磨細(xì)劑的吸附也可導(dǎo)致?lián)p失。⑵物理方法主要通過各種物理因素的作用，使組織細(xì)胞破碎的方法。Ⅰ反復(fù)凍融法于冷藏庫(kù)或干冰反復(fù)于零下15～20℃使之凍固，然后緩慢地融解，如此反復(fù)操作，使大部分細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)顆粒破壞。由于滲透壓的變化，使結(jié)合水凍結(jié)產(chǎn)生組織的變性，冰片將細(xì)胞膜破碎，使蛋白質(zhì)可溶化，成為粘